۵ خطای رایج در استخراج RNA با TRIzol + روش‌های رفع مشکل

• کاهش مقدار RNA استخراج شده
• RNA تخریب شده
• کاهش نسبت 260/280
• آلودگی DNA
• رنگی بودن فاز آبی بالا

استخراج RNA یکی از فرایند های مهم در بررسی های بیولوژیک و مولکولی است که تکنیک های متعددی چون Real Time PCR، RNA Sequencing، کلونینگ ژن و… مورد ارزیابی قرار میگیرد.

چرا مقدار RNA کم شده

دو عامل اصلی آن، عدم دسترسی کامل ترایزول به سلول ها و لیز آنها به طور کامل و انحلال کم رسوب RNA در محلول نهایی هستند. همانطور که میدانید، هر چه نسبت سطح به حجم بالاتر باشد، دسترسی ترایزول به سطح سلول ها افزایش پیدا کرده و سلول های بیشتری لیز شده و در نهایت RNA بیشتری استخراج میشود. از این رو هموژن شدن بافت های جامد که سلول ها به یکدیگر متصل هستند، یکی از مراحل مهم قبل از شروع استخراج میباشد. به همین جهت باید درنمونه های بافتی، سلول ها به طور کامل از یکدیگر جدا شده و هیچ گونه پارتیکلی مشاهده نشود.

همچنین در نهایت، رسوب RNA باید به طور کامل در آب DEPC treated یا TE حل شود. بدین منظور یکی از نکات اصلی، عدم خشک شدن رسوب در مرحله شستشو اتانولی قبل، به مدت طولانی است. در این خشک شدن اتانول، باید رسوب RNA تا حدی خشک شود که قطرات اتانول مشاهده نشده و رسوب RNA مقداری از رنگ شیری مات، به شفاف تغییر کند، که این زمان بسته به دمای محیط از 20-40 دقیقه متغیر است. افزایش مدت زمان خشک شدن باعث سخت شدن میزان انحلال پذیری RNA استخراج شده در بافر نهایی میشود. راه حل بعدی برای این مسئله، حرارت دادن در دمای 55 درجه به مدت 15 دقیقه، جهت حل شدن بیشتر رسوب RNA میباشد.

چرا RNA در الکتروفورز، اسمیر میشود(RNA تخریب شده)

• تخریب RNA در نمونه، قبل از شروع استخراج: به علت وجود نوکلئاز های زیاد در ارگانل های سلولی، عدم نگهداری نمونه در شرایط مناسب، موجب آزاد سازی این نوکلئاز ها و تخریب RNA در داخل سلول قبل از شروع فرایند استخراج میشود. راه حل: نمونه سریعا تحت فرایند استخراج RNA قرار گیرد و از فریز و دفریز کردن مکرر نمونه خودداری شود
• عدم نگهداری RNA استخراج شده در شرایط مناسب: بهتر است RNA را در فریزر -80 نگهداری کنید و یا سریعا به cDNA تبدیل کنید.

کاهش نسبت 260/280 به کمتر از 1.65

• وجود آلودگی فنول و کلروفرم در RNA. راه حل: دقت در جدا سازی فاز رویی بدون برداشت از لایه هایی زیرین
• استفاده مقدار ناکافی از ترایزول، به نسبت مقدار نمونه. راه حل مقدار مناسب، 1 میلی لیتر ترایزول به ازای نهایتا 50 میلی گرم نمونه یا 10⁶ سلول
• انکوباسیون کم: انکوباسیون مرحله لیز به مدت 5 دقیقه در دمای محیط. (کاهش زمان انکوباسیون باعث لیز ناکافی، افزایش زمان موجب تخریب RNA میشود.)
• PH RNA اسیدی: حل شدن RNA در آب مقطر به علت PH کم اسیدی میتواند موجب کاهش نسبت 260/280 شود در نتیجه میتوانید RNA را در TE Buffer نوکلئاز فری با pH 8 حل کنید

وجود DNA در نمونه RNA

• یکی از علت ها، برداشت لایه اینترفاز حاوی DNA میباشد. در اولین سانتریفیوژ و جداسازی فازها، RNA در فاز بالا، DNA در فاز میانی و سایر اجزا و مواد در فاز زیرین قرار میگیرند. راه حل: دقت در برداشت لایه رویی
• مقدار ناکافی ترایزول: راه حل مقدار مناسب، 1 میلی لیتر ترایزول به ازای نهایتا 50 میلی گرم نمونه یا 10⁶ سلول
• وجود محلول هایی مثل DMSO و اتانول در نمونه: راه حل: عدم وجود این مواد در نمونه ، عدم نگهداری بافت جامد در این مواد، شستشو بافت یا سلول با PBS استریل

رنگی بودن فاز آبی

• وجود چربی در نمونه هایی مثل پوست یا بافت چربی، موجب جذب رنگ قرمز ترایزول در خود میشوند. راه حل: قبل از افزودن کلروفرم، لیزات را به منظور رسوب چربی، سانتریفیوژ کنید
• نمونه های خونی در صورت لیز ناکافی، موجب قرمز شدن فاز آبی رویی میشوند. راه حل: رعایت نسبت ترایزول به نمونه خون
• ممکنه بعد از اضافه کردن ایزوپروپانول به سوپرناتانت، رنگ زرد ایجاد شود. راه حل: استفاده از ایزوپروپانول تازه

نتیجه

با رعایت موارد گفته شده در کنار استفاده از ترایزول با فرمولاسیونی بهینه جهت لیز کامل سلول، دناتوره کردن پروتئین ها، حفظ شرایط pH جهت رسوب DNA و جداسازی از سوپرناتانت حاوی RNA و حفظ RNA از شکست های مکانیکی، هیدرولیز و آنزیمی میتوانید RNA با درصد خلوص بالا بدون مهارکنندگی آنزیمی استخراج کنید.

ترایزول شرکت دانش بنیان راتین ژن

برند Technogene