ترایزول Technogene|محلول استخراج RNA

• بر پایه فنول-کلروفرم و نمک گوانیدیوم تیوسیانات
• با فرمولاسیونی بهینه شده جهت استخراج RNA تام از جمله mRNA و microRNA
• حفظ RNA از تخریب(باند های شارپ rRNA)
• فاقد آلودگی DNA
• فاقد مهار کننده آنزیم های Reverse Transcriptase، Poly(A) Polymerase و Taq Polymerase
• برند Technogene

ترایزول چیست؟

ترایزول، محلولی بر پایه نمک های فنول، گوانیدیوم تیوسیانات و نمک هایی جهت فراهم آوردن شرایط بافری مورد نیاز میباشد که از آن در استخراج RNA, DNA و پروتئین سلولی از سایر اجزا استفاده می‌شود. این محلول با قدرت نمکی و یونی بالای خود، یکی از قدرتمندترین محلول های جداسازی ماکرومولکول های زیستی سلول می‌باشد. به صورتی که علی رغم قدیمی بودن زمان اکتشاف و به وجود آمدن مواد و روش های جدید، کماکان مورد استفاده قرار میگیرد

کاربرد ترایزول

در تحقیقات بررسی بیان ژن، کلونینگ ژن، سکانس ژنتیکی، پروتئومیکس و سایر تحقیقات بر روی ماکرومولکول های زیستی RNA, DNA Protein مورد استفاده قرار میگیرد. بسته به نیاز، یکی از این اجزا از سایر اجزای سلولی به صورت خالص، جداسازی میشود

پروتکل استخراج RNA با ترایزول

یکی از نکات مهم جهت استخراج، افزایش نسبت سطح به حجم نمونه سلولی جهت تماس با محلول ترایزول میباشد. بدین معنی که هر چه نمونه زیستی به صورت تک سلول جداگانه از هم باشد، تماس محلول به سلول افزایش پیدا میکند. نسبت به تکه ای از بافت که فقط سطح بیرونی آن با محلول برخورد میکند.

نمونه های محلولی از جمله خون، نیازی به مرحله آماده سازی نداشته و به صورت مستقیم امکان استفاده دارند. نمونه های کشت سلول و میکروب، پس از سانتریفیوژ و جداسازی از محیط کشت، با محلول هایی از جمله بافر PBS، به صورت محلول هموژن با سلول های دفیوژ شده از هم در می‌آیند.

روش های هموژن کردن نمونه بافتی

•  خرد کردن فیزیکی بافت با نیتروژن مایع
•  تجزیه شیمیایی اتصالات سلولی با استفاده از محلولی مثل RIPA که حاوی دترجنت های متعددی است
•  تخریب مکانیکی با استفاده از بید های شیشه ای یا دستگاه هموژنایزر که بافت را به تیکه های کوچکتر تبدیل میکند
• و…

مخلوط سازی و انکوباسیون

پس از آماده سازی نمونه، مقدار مشخصی از آن با ترایزول مخلوط شده، بر روی یخ، 3-5 دقیقه انکوبه میشود. افزایش زمان و دما، ممکن است موجب تخریب RNA شود.

جداسازی RNA

با افزودن کلروفرم یه لیزات مرحله قبل، فنول در کلروفرم حل شده و پس از سانتریفیوژ در دور 18000RCF در دمای 4 درجه سانتیگراد، RNA در سوپرناتانت و DNA و پروتئین در لایه های زیرین قرار میگیرند.

رسوب RNA

پس از جدا سازی سوپرناتانت حاوی RNA و ریختن آن در میکروتیوب RNase Free، هم حجم سوپرناتانت، ایزوپروپانول سرد اضافه میشود و 10دقیقه تا over night  در دمای فریزر انکوبه شده و در نهایت در دور 18000RCF به مدت 20 دقیقه سانتریفیوژ میشود.

شستشو رسوب RNA

رسوب حاصل از مرحله قبل، یک تا سه مرتبه با اتانول 75 درصد شستشو میشود(  سانتریفیوژ 10000RCF به مدت 20 دقیقه )

خشک کردن رسوب RNA

پس از خالی کردن محلول شستشو(اتانول 75%)، درب میکروتیوب را در دمای اتاق باز گذاشته تا اتانول تبخیر شود. ( در دمای 25 درجه سانتیگراد تقریبا 20 دقیقه. طولانی شدن زمان و خشک شدن زیاد رسوب، موجب اختلال در حل شدن RNA در مرحله بعدی میشود)

حل کردن RNA

در نهایت بسته به مقدار رسوب، محلول TE بافر و یا DEPC Treated Water به رسوب اضافه و پس از چند دقیقه انکوباسیون، رسوب حل شده و آماده استفاده و یا ذخیره در دمای -80 میشود.

سوالات متداول(FAQ)

آیا با TRIzol می‌توان DNA و پروتئین را نیز استخراج کرد؟

بله، یکی دیگر از کاربرد های محلول ترایزول، استخراج DNA و پروتئین از لایه های زیرین حاصل از جداسازی فازها پس از سانتریفیوژ است. DNA در لایه میانی و پروتئین در فاز زیرین قرار میگیرد. هر کدام را با استفاده از پروتکل جداگانه توسط اتانول یا ایزوپروپانول رسوب داده، توسط بافر های سیترات سدیم، اتانول و… شستشو داده و استخراج میکنیم.

آیا ترایزول برای استخراج RNA از سلول‌های کشت‌شده مناسب است؟

بله. سلول های کشت داده شده را ابتدا با سانتریفیوژ در دور پایین، از محیط کشت جدا می‌کنیم. سپس به منظور شستشو میتوان با بافر فسفات PBS استریل و سرد محیط کشت اضافه را حذف و در نهایت با اضافه کردن 200 میکرولیتر PBS، رسوب سلولی را به حالت سوسپانسیون در می‌آوریم. با افزودن ترایزول، ادامه فرایند استخراج را انجام می‌دهیم.

آیا می‌توان از ترایزول برای استخراج RNA از بافت استفاده کرد؟

در نمونه بافتی، سلول ها به یکدیگر متصل شده و دسترسی محلول ترایزول به سلول های مرکزی در بافت محدود می‌شود. بدین منظور ابتدا باید سلول ها را از هم دفیوز کرده و به صورت سوسپانسیون سلولی در آوریم. با استفاده از روش های متعدد آنزیمی، شیمیایی، محلول های حاوی دترجنت، ازت یا نیتروژن مایع، روش تخریب فیزیکی توسط هموژنایزر و… سلول ها  از هم جدا شده تا نسبت سطح به حجم جهت دسترسی محلول ترایزول به تمامی سلول ها افزایش پیدا کند.

چه مقدار نمونه برای استخراج RNA با TRIzol لازم است؟

تمامی نمونه ها جهت شروع فرایند استخراج با ترایزول، باید حالت محلول یا سوسپانسیون سلولی داشته باشند. در این حالت 200 میکرولیتر از نمونه را با 1 سی سی از ترایزول مخلوط می‌کنیم.  در نمونه های بافتی 50-100 میلی گرم از بافر را جدا کرده و به حالت سوسپانسیون در می‌آوریم. برای نمونه های سلولی، 1 میلیون (10⁶) سلول لازم است.

چرا در روش TRIzol از کلروفرم استفاده می‌شود؟

کلروفرم حلال فنل است. در انکوباسیون اولیه، فنل پروتئین ها را دناتوره می‌کند و سپس باید از محلول رویی حاوی RNA جدا شود. با افزودن کلروفرم، فنل در آن حل شده و به علت چگالی بالا، پس از سانتریفیوژ، پایین میکروتیوب جمع می‌شود که فنل را هم به همراه خود پایین می‌برد.

نقش ایزوپروپانول در استخراج RNA چیست؟

ایزوپروپانل با کاهش برهم کنش های هیدروژنیRNA با مولکول آب، کاهش ثابت دی الکتریک آب و خنثی سازی بار های منفی گروه فسفات RNA، انحلال پذیری RNA را در آب فاز رویی کاهش داده و در سانتریفیوژ با نیروی گریز از مرکز موجب رسوب RNA می‌شود.

چگونه کیفیت RNA استخراج‌شده را بررسی کنیم؟

در ابتدا با استفاده از نانودراپ، غلظت RNA، نسبت های 260/280و 260/230 را بررسی می‌کنیم. نسبت های 260/280و260/230 جهت بررسی خلوص RNA، عدم وجود پروتئین و نمک های اضافه اندازه گیری می‌شوند. سپس به منظور اطمینان از عدم وجود DNAژنومیک، سالم بودن RNA( اسمیر نشدن)، مقداری از RNA را در ژل آگارز 1% الکتروفورز می‌کنیم.

نسبت A260/A280 مناسب برای RNA چقدر است؟

نسبت ایده آل، 1.8-2 می‌باشد. کاهش این نسبت به معنی وجود پروتئین، نمک های اضافه می‌باشد که باید نتایج آن را با نتایج 260/230 بررسی کرد.(260/230 پایین به منزله وجود نمک های اضافه در کنار RNA است)

آیا trizol ویروس‌ها و RNaseها را غیرفعال می‌کند؟

وجود نمک های گوانیدیوم تیوسیانات و فنل در ترایزول، که از دناتوره کننده های قوی پروتئین و آنزیم ها هستند، ویروس، سلول زنده و حتی آنزیم ها از جمله RNase را غیرفعال می‌کند. اما این موضوع به معنی کاهش اهمیت آلودگی RNase نیست. صرفا در مرحله اولیه این آنزیم غیر فعال می‌شود. در ادامه مراحل باید محیط، تمامی وسایل و مواد مصرفی RNase free بوده تا از انتقال آن از محیط  به نمونه RNA جلوگیری کند.

تفاوت TRIzol با کیت‌های ستونی استخراج RNA چیست؟

روش ترایزول با تکیه بر رسوب RNA عمل کرده، اما روش ستونی با جدا سازی RNA توسط سیلیس موجود در ستون سیلیکا، این کار را انجام می‌دهد. روش ستونی از سرعت عمل بالاتری برخوردار است اما غلظت و مقدار RNA استخراج شده توسط ترایزول بیشتر از سایر روش ها می‌باشد.

محلول TRIzol چگونه نگهداری می‌شود؟

فنل و گوانیدیوم موجود در ترایزول، به اکسیداسیون حساسیت بالایی دارند. طبق دستورالعمل ترایزول باید در دمای یخچال نگهداری شود و فریز کردن آن تاثیر چندانی بر ممانعت از اکسیداسیون ندارد. نگهداری در دمای خنک، به دور از نور آفتاب( نگهداری در ظروف شیشه ای تیره و در بسته) از الزامات نگهداری است.

آیا غلظت بالای RNA در نانودراپ لزوما به معنی استخراج خوب است؟

غلظت بالا و حتی نسبت های 260/280 , 260/230 خوب، تضمین کننده سالم بوده قطعات RNA و عدم حضور DNA در نمونه نیست.  حتما RNA استخراج شده را قبل از سنتز cDNA، توسط الکتروفورز آگارز چک کنید.

از کجا محلول ترایزول با کیفیت تهیه کنیم؟

شرکت دانش بنیان راتین ژن، با علم به تمامی نکات مربوط به محلول سازی، پایداری مواد و نمک های سازنده ترایزول و رعایت شرایط استریل و RNase free این محلول را تولید و با برند Technogene عرضه کرده است. میتوانید جهت کسب اطلاعات بیشتر با ما در ارتباط باشید