در کلونینگ کلاسیک، vector و insert برش خورده طی واکنش آنزیم T4 Ligase به یکدیگر متصل می‌شود. اتصال بهینه وکتور به insert مستلزم رعایت نسبت تعداد آنها به یکدیگر است تا از اتصالات متفرقه وکتور ها یا insertها به یکدیگر جلوگیری شود. این نسبت ها نیازمند محاسباتی است که در ادامه توضیح داده شده است.

واکنش T4 ligase

 در این واکنش آنزیم لیگاز انتهای چسبنده  دو سر وکتور و دو سر insert را به یکدیگر متصل می‌کنند. اما در کنار اتصال وکتور به قطعه هدف، اتصالات دیگری هم ایجاد می‌شوند:

• اتصال insert-insert و حتی insert-insert-insert-insert
• اتصال vector-vectorو حتی vector-vector-vector

که در اینجا هدف ما اتصال حلقوی vector-insert است.

این اتصال حلقوی insert-vector ملزم رعایت کردن مقادیر و نسبت های مولی دو قطعه هستند. نسبت زیاد قطعات insert نسبت به وکتور، باعث افزایش اتصالاتinsert-insert شده و نسبت زیاد وکتور موجب افزایش اتصالات وکتور-وکتور می‌شود. که موجب کاهش راندمان کلونینگ اصلی و کاهش تعداد کلونی های هدف می‌شود.

رعایت نسبت های مولی در کلونینگ

دو نکته در محاسبه مقادیر قطعه insert و وکتور  حائز اهمیت است.

1. نسبت طول قطعه هدف و طول وکتور
2. تعداد رشته هدف نسبت به هر رشته وکتور

به عنوان مثال، ما قصد داریم insert با طول 1000bp را وارد وکتوری با طول 5000جفت باز کنیم.( در این مثال، اعداد گفته شده فرضی است و جهت درک بهتر گفته می‌شود!)

در بروشور کیت T4 Ligase تولید کننده، میگه آنزیم من ظرفیت اینو داره که  100 نانوگرم DNA رو چک کنه، هر جا برشی وجود داشت به هم متصل کنه.

پس ما مجموعا میتونیم 100ng وکتور و insert رو با هم مخلوط کنیم.

از طرف دیگه باید نسبت تعداد هر مولکول وکتور با insert هم رعایت بشه. مثلا اگه به جای 1 وکتور، 5 عدد قطعه insert داشته باشیم، احتمال بیشتری وجود داره که insert وارد وکتور بشه تا 1 وکتور و 1 insert.

ولی دیگه حدی هم داره; نمیشه 1 وکتور گذاشت 10 تا insert چون از اون طرف بوم می‌افتیم و اتصالات insert-insert زیاد میشه   

از طرف دیگه اگه نسبت وکتور به insert کمتر باشه، وکتور های زیادی بدون بارگیری insert بسته میشن

پس باید این نسبت تعداد وکتور و insert رعایت بشه

حالا یه سوال؟

ما دوتا میکروتیوب داریم که یکیش پلاسمید برش خورده داره، یکیش insert برش خورده. چطور بفهمیم در هر میکرولیتر از این نمونه ها، چند عدد وکتور وجود داره و چند عدد insert?  که بخوایم مقداری از هر کدام رو برداریم تا نسبت گفته شده رعایت شود.

اینجا نسبت مولی مطرح میشه.

در شیمی مول، یه واحد برای تعداد مولکول هست

وقتی میگیم نسبت مولی insert:vector 5:1  باشه  یعنی به ازای 1 عدد وکتور، 5 تا insert با هم مخلوط بشن.

اما چون کیت T4 Ligase واحدی که گفته ng هست که واحد جرمه،  باید این دوتا واحد رو برای پلاسمید و insert به هم ربط بدیم.

ارتباط جرم به تعداد مولکول

برای ارتباط دادن جرم (ng) به تعداد مولکول‌ها (مول) باید به این نکته توجه کنیم که جرم هر مولکول DNA به طول آن بستگی دارد.

هرچه یک قطعه DNA طولانی‌تر باشد، جرم یک مولکول از آن بیشتر است. بنابراین اگر دو نمونه جرم یکسانی داشته باشند، نمونه‌ای که قطعات کوتاه‌تری دارد، تعداد مولکول‌های بیشتری خواهد داشت.

مثلاً اگه:

• وکتور = 5000 bp
• اینسرت = 1000 bp

باشه، هر مولکول وکتور تقریباً ۵ برابر سنگین‌تر از هر مولکول اینسرت هست

پس  اگه از هر کدام 100 نانوگرم برداریم، تعداد مولکول‌های آن‌ها برابر نخواهد بود؛ بلکه تعداد مولکول‌های اینسرت تقریباً ۵ برابر تعداد مولکول‌های وکتور میشه.

به همین دلیل، هنگام طراحی واکنش لیگاسیون، مقدار DNA را فقط بر اساس نانوگرم انتخاب نمی‌کنیم، بلکه ابتدا نسبت مولی موردنظر (مثلاً 3:1 یا 5:1) را مشخص می‌کنیم و سپس با توجه به طول وکتور و اینسرت، محاسبه می‌کنیم که از هر نمونه چند نانوگرم باید برداریم.

به همین دلیل فرمول زیر استفاده می‌شود:

جرم Insert (ng) = جرم Vector (ng) × (طول Insert (bp) تقسیم بر طول Vector (bp)) × نسبت مولی

مثلاً اگر:

• وکتور = 5000 bp
• اینسرت = 1000 bp
• جرم وکتور = 50 ng
• نسبت مولی موردنظر = 3:1

باشه، میشه

جرم اینسرت = 50 × (1000 ÷ 5000) × 3 = 30 ng

یعنی برای اینکه به ازای هر یک مولکول وکتور، سه مولکول اینسرت داشته باشیم، باید 50 نانوگرم وکتور را با 30 نانوگرم اینسرت مخلوط کنیم.

محاسبه حجم پلاسیمد و insert

در محاسبات قبلی، مقدار ng وکتور و insert مورد نیاز به دست آمد، حال نوبت به محاسبه مقدار محلول حاوی پلاسمید و insert رسیده است

با استفاده از نانودراپ غلظت این دو اندازه گیری میشود، عددی که نمایش میدهد واحد ng/µl دارد.

در مثال بالا:  غلظت پلاسمیدمون  با نانودراپ، 20ng/µl و غلظت محلول insert 10ng/µl

یعنی در هر میکرولیتر پلاسمید، 20  نانوگرم   و هر میکرولیتر محلول اینسرت 10 نانوگرم DNA داره

خب ما برای واکنش بالا، 50 گرم پلاسمید لازم داریم و 30 گرم اینسرت

پس باید 2.5 میکرولیتر از محلول پلاسمید برداریم و 3 میکرولیتر محلول حاوی قطعه اینسرت برداریم .

محاسبه مقادیر مورد نیاز برای واکنش Ligation بدون نیاز به محاسبات

ما در اینجا تمامی محاسبات مورد نیاز را، در قالب یک المان، آماده کرده ایم. میتوانید با وارد کردن اطلاعات خواسته شده، به راحتی مقادیر مورد نیاز را بدست آورید.