استخراج RNA، نکات کلیدی، مشکلات رایج و راه حل

استخراج RNA یکی از مراحل کاربردی در بررسی های بیولوژیک است که نقش مهمی در تحقیقات ژنتیک، بیوتکنولوژی و تشخیص بیماری‌ها دارد. RNA یا ریبونوکلئیک اسید، مولکولی حساس و ناپایدار است که برای مطالعه بیان ژن، طراحی واکسن و بسیاری از فرآیندهای تحقیقاتی دیگر ضروری است. در این مقاله، ما به بررسی کامل مراحل استخراج RNA، نکات کلیدی و چالش‌های رایج می‌پردازیم.

RNA چیست و چرا اهمیت دارد؟

RNA نوعی اسید نوکلئیک تک رشته ای است که از نظر ساختار و عملکرد با DNA تفاوت دارد که در آن بازهای آلی Ribonuleotide، (A (Adenine), U(Uracil) G(Guanine), C(Cytosine)) توسط پیوند های فسفودی استر به یکدیگر متصل شده اند . این مولکول مسئول انتقال اطلاعات ژنتیکی از DNA به ریبوزوم‌ها و همچنین تنظیم فرآیندهای ژنتیکی و بیوشیمیایی در سلول‌ها می باشد و استخراج RNA باکیفیت بالا برای تحلیل‌های دقیق ژنتیکی مانند RT-PCR، RNA-Seq و Northern Blot ضروری می باشد.

استخراج RNA

فرآیند استخراج RNA شامل جداسازی RNA از دیگر مولکول‌های زیستی سلول مانند DNA، پروتئین‌ها و لیپیدها است. روش‌های مختلفی برای استخراج RNA وجود دارد که به نوع نمونه و هدف تحقیق بستگی دارد; دو روش رایج آن عبارتند از:

• روش دستی (شامل روش ستون سیلیکا و فنل-کلروفرم(ترایزول)): این روش‌ها نیازمند مهارت و دقت بالا هستند و با صرف هزینه ای به صرفه تر می توان RNA با کیفیت استخراج کرد.
• روش‌های خودکار (دستگاه اتوماتیک): روشی سریع، تکرارپذیر و مناسب برای حجم بالای نمونه‌ است که بر پایه استفاده از نانوذرات سیلیس مگنتیک طراحی شده و تمام فرایند توسط دستگاه به صورت اتوماتیک یا نیمه اتوماتیک انجام می‌شود.

مقایسه روش ها

مواد و تجهیزات مورد نیاز استخراج RNA با ترایزول

برای استخراج RNA به روش رسوبی، به مواد و تجهیزاتی استریل و عاری از RNase نیاز داریم.

همچنین تمام مراحل زیر هود شیمیایی انجام شده و استفاده از دستکش و روپوش الزامی است.

محلول ها

• TRIzol 
• کلروفرم
• ایزوپروپانول
• اتانول 70%
• DEPC Treated water

تجهیزات

• سمپلر(micropipette)
• سرسمپلر(Pipette tip)
• سانتریفیوژ یخچالدار با سرعت بالا
• ورتکس(Vortex)
• رک میکروتیوب

مراحل گام‌به‌گام استخراج RNA

1. نگهداری نمونه

توصیه می‌شود استخراج RNA را از نمونه های تازه انجام دهید، اما در صورت عدم امکان در مواقعی که نمونه های پروژه به صورت تکی و با تعداد کم آماده می‌شوند، تا تکمیل تعداد کامل نمونه ها میتوان آن را فریز کرد. که برای این منظور، دمای 20- توصیه نشده و فریز 80- یا تانک ازت RNA را بهتر حفظ می‌کند.

• نمونه سلولی: سلول های کشت داده شده را با سانتریفیوژ از محیط کشت جدا کرده و رسوب سلولی را بلافاصله فریز می‌کنیم. هر چه این فرایند سریعتر انجام شود، RNA کمتر در معرض آنزیم های RNase داخل سلولی قرار می‌گیرد.
• نمونه خون: اگر هدف استخراج از سلول های PBMC و یا لوکوسیت ها است، ابتدا توسط محلول فایکول(Ficoll) یا با شستشو و حذف RBC ها توسط محلول RBC lysis solution، سلول های هسته دار خون را جدا کرده و سپس آنها را سریعا فریز کنید. اگر قصد استخراج از خون کامل را دارید، نمونه را سریعا فریز کرده اما از فریز- دفریز (Freeze and Thaw) کردن آن خودداری کنید. زیرا با فریز کردن، غشا گلبول های قرمز لیز شده و RNA داخل سلولی در معرض تخریب قرار میگیرد. جهت استخراج، زمانی که نمونه خون فریز شده هنوز منجمد است، محلول ترایزول را روی آن ریخته تا حین ذوب شدن، سریعا ترایزل باعث مهار آنزیم های ریبونوکئاز شود.
• نمونه بافت: بافت را در محلول RNA Later گذاشته و سریعا فریز کنید. در روز استخراج، نمونه بافتی را با استفاده از نیتروژن مایع، دستگاه هموژنایزر، به صورت سوسپانسیون سلولی در آورده RNA را استخراج کنید.

2. لیز سلولی

فنل و گوانیدیوم تیوسیانات موجود در محلول ترایزول، غشا سول را تخریب کرده و پروتئین های دیواره سلولی و سیتوپلاسمی را دناتوره می‌کند. مدت زمان این مرحله 3-5 دقیقه بوده و افزایش این زمان به علت pH اسیدی محلول ترایزول، موجب تخریب RNA می‌شود.

3. ایجاد فاز های جدا از هم

با اضافه کردن کلروفرم، فنل موجود در TRIzol در آن حل شده و به واسطه چگالی بالاتر، کلروفرم با سانتریفیوژ در پایین میکروتیوب قرار گرفته و همزمان، سایر اجزای سلولی نیز به فازهای زیرین منتقل شده و RNA در سوپرناتانت( فاز آبی رویی) قرار می‌گیرد.

در این مرحله با مخلوط کردن کلروفرم و لیزات، رنگ محلول تغییر کرده و تاحدودی کدر می‌شود. پس از آن به مدت 5 دقیقه در دمای اتاق نگهداری کرده تا فنل به طور کامل در کلروفرم حل شود.

سپس با سانتریفیوژ در دور 12000RCF به مدت 20 دقیقه در دمای 4 درجه سانتی گراد توسط سانتریفیوژ یخچالدار، محلول 3 فازی ایجاد می‌شود که در فاز آبی رویی RNA قرار گرفته و در فاز میانیDNA و در فاز زیرین، کلروفرم، فنل، پروتئین، لیپید، پلی ساکارید ها و… قرار میگیرند.

4.رسوب RNA

پس از جدا کردن فاز روی حاوی RNA، باید آن را رسوب دهیم. یکی از محلول های رسوب دهنده RNA، ایزوپروپانول سرد است که در این مرحله، هم حجم محلول سوپرناتانت، اضافه شده، مخلوط کرده و از در فریزر -20 یا -80 انکوبه می‌کنیم. هر چه مدت زمان انکوباسیون بیشتر شود، RNA های کوچک به میزان بیشتری رسوب کرده و در نهایت غلظت بیشتری به دست می‌آید، که این مدت میتواند از 20 دقیقه تا over night باشد.

رسوب RNA با گلیکوژن

همچنین میتوانید در این مرحله با افزودن گلیکوژن به میزان 10-20 μg، رسوب RNA را تقویت کنید. در نمونه های که مقدار RNA کمی دارند( مثل سرم یا پلاسما)، به علت غلظت پایین، رشته های RNA نمیتوانند یک شبکه به هم متصل بزرگ تشکیل داده تا رسوب به خوبی انجام شود، در این مواقع با افزودن گلیکوژن که خود نیز در الکل نامحلول است، شبکه ای از گلیگوژن ایجاد شده و حین رسوب خود، شبکه های کوچک RNA را نیزبا خود رسوب می‌دهند.

پس از آن در دور 12000rcf به مدت دقیقه در دمای درجه سانتریفیوژ میکنیم

5. شستشو RNA

در مرحله قبل، رسوب RNA کف میکروتیوب ایجاد می‌شود که پس از خالی کردن محلول، نوبت به شستشو رسوب می‌رسد.. در این مرحله از اتانول 75 درصد استفاده می‌شود. اتانول همچنان موجب نامحلول ماندن RNA شده و مواد و نمک های اضافی در آن حل شده و شستشو داده می‌شوند

در این مرحله 2-3 مرتبه میزان 1 سی سی اتانول 75% اضافه شده، هم زده و سانتریفیوژ( دور 10000RCF به مدت 10 دقیقه) می‌کنیم.

حین بیرون ریختن محلول رویی، مراقب رسوب RNA باشد که جدا نشده و دور ریخته نشود.

6. خشک کردن رسوب RNA

میکروتیب حاوی RNA را در دمای اتاق نگه داشته تا اتانول اضافه تبخیر شود.

در این مرحله، رسوب شیری رنگ RNA، شفاف می‌شود. که این مدت حدودا 20 دقیقه در دمای 25 درجه اتفاق می‌افتد.

از بیشتر ماندن و خشک شدن بیش از حد رسوب RNA جلوگیری کنید، زیرا با این اتفاق، حل شدن RNA در مرحله بعد در آب به خوبی انجام می‌شود. در نتیجه با نگاه کردن به رسوب و ندیدن قطرات اتانول و تغییر رنگ از شیری به شفاف، این خشک شدن کفایت می‌کند.

7. حل کردن RNA

در این مرحله RNA را در آب DEPC Treated که RNase free شده است حل میکنیم. و همچنین میتوانید در بافر TE(10mM Tris Hcl ph8, 1mM EDTA) که RNase free شده است، استفاده کنید.

مقدار آب یا بافر مورد نیاز این مرحله، به غلظت RNA مورد نیاز بستگی دارد، اگر مقدار RNA کم بوده یا غلظت بیشتری لازم دارید، 20 میکرولیتر اضافه کنید و در غیر این صورت میتوانید مقدار بیشتری به رسوب RNA بزنید.

مشکلات رایج و راه‌حل‌ها

• RNA تخریب شده: اطمینان حاصل کنید که تمامی ابزارها و مواد شما عاری از RNase باشند.
• غلظت پایین RNA: میزان نمونه اولیه را افزایش دهید یا از کیت با حساسیت بالاتر استفاده کنید.
• آلودگی با DNA: از DNase برای حذف DNA مزاحم استفاده کنید.

*در صورتی که از محلول ترایزول بهینه استفاده کنید، DNA در مرحله سانتریفیوژ اولیه، همراه با پروتئین و سایر اجزا رسوب کرده و در محلول رویی و نمونه RNA، میزان آن کاهش پیدا می‌کند.

جمع بندی

استخراج RNA یک فرآیند حساس و حیاتی در بررسی های بیولوژیک می باشد و با رعایت اصول کار و استفاده از روش‌های مناسب، می‌توان RNA باکیفیت بالا را برای اهداف متنوع به دست آورد. استفاده از کیت‌های تخصصی و تجهیزات پیشرفته می‌تواند دقت و سرعت کار را بهبود بخشد. اگر شما به دنبال کیت‌ها و محصولات باکیفیت برای استخراج RNA هستید، شرکت دانش بنیان راتین ژن با بهره گیری از مواد اولیه با کیفیت و فرمولاسیونهایی بهینه و با تحقیق و توسعه فراوان توسط تیم متخصص خود محصولات    Total RNA Extraction Kit ,RBC Lysis Buffer, Trizol  را برای شما محققین محترم فراهم آورده است.

سوالات متداول

منابع علمی مرتبط

• Optimization of phenol-chloroform RNA extraction(https://doi.org/10.1016/j.mex.2018.05.011)
• Comparison of different methods of total RNA extraction for viral detection in sputum(https://doi.org/10.1016/S0166-0934(01)00284-1)
• Purification of RNA using TRIzol (TRI reagent)‏