جلوگیری از تخریب RNA

حفظ یکپارچگی RNA، جلوگیری از تخریب فیزیکی، شیمیایی و آنزیمی RNA، در نمونه، حین استخراج، آزمایش و نگهداری در پروژه های تحقیقاتی و تشخیصی اهمیت بالایی دارد.

حفظ یکپارچگی رشته RNA

اهمیت این موضوع در رشته ها یmRNA با طول بلند بسیار بیشتر است. همانطور که میدانید طول رشتهmRNA بسیار متغییر است و توالی هایی بالای 10000 نوکلئوتید نیز وجود دارد. سنتز cDNA از mRNA با استفاده از پرایمر Oligo (dT) از انتهای دم پلی A آغاز شده و به سمت سر 5′ ادامه پیدا میکند. درصورتی که رشته RNA به صورت کامل و یکپارچه حفظ شده باشد، تمامی اگزون هایmRNA یوکاریوتی به cDNA تبدیل میشوند. اما اگر RNA از وسط به علت های مختلف شکسته شود، فقط بخشی که به دم پلی A چسبیده است به cDNA تبدیل میشود اما بخش بالاترخیر. حال اگر هدف آزمایش ما اگزونی بالادست محل شکست باشد، cDNA برای آن تشکیل نمیشود. به همین دلیل است که حفظ RNA اهمیت دارد.

تخریب فیزیکی RNA

در مراحل مختلفی احتمال این اتفاق وجود دارد.

تخریب فیزیکی در استخراج RNA

استفاده از ورتکس شدید، دمای بالا، دور سانتریفیوژ بسیار بالا و… از جمله عوامش شکست RNA هستند

تخریب شیمیایی

بخش زیادی از این اتفاق به فرمولاسیون محلول لیزکننده و یا ترایزول بستگی دارد. pH محلول یکی از عوامل کلیدی در حفظ RNA است. در استخراج با استفاده از ترایزول، به منظور جداسازی DNA از RNA،اسیدیته ترایزول حدود 4 تنظیم میشود. در این pH DNAحالت نامحلول داشته و با سانتریفیوژ از RNA جدا میشود. حال این pH لبه پرتگاهیست که اگر بالا باشد، آلودگی DNA در نمونه RNA را به همراه دارد، اگر پایینتر باشد موجب تخریب RNA میشود.

علت تخریب در PH اسیدی، هیدرولیز اسیدی آمین در باز ها و پیوند فسفودی استری است

تخریب آنزیمی RNA

مهمترین دشمن RNA، ریبونوکئازها (RNase) هستند. این تجزیه هم در مرحله نمونه گیری، نگهداری نمونه قبل از استخراج، حین استخراج RNA و ذخیره و حین انجام آزمایش امکان بروز دارد.

تخریب RNA حین نمونه گیری

از آنجایی که در ارگانل های سلولی، آنزیم های متعددی از جمله RNase وجود دارد، حفظ سلولها از پاره شدن غشا سلولی و ارگانل ها اهمیت بالایی دارد. به عنوان مثال در خونگیری، شدت ساکشن سرنگ و لیز RBC هامیتواند موجب آزاد سازی RNase ها شود. مراحل شستشو و جداسازی سلول کشت داده شده از محیط کشت نیز در این مورد موثر است.

تخریب RNA در زمان نگهداری نمونه

• فریز و دفریز کردن نمونه: موجب تخریب غشا فسفولیپیدی سلول و ارگانل های داخل سلولی و آزادسازی آنزیم ها میشود
• عدم فریز کردن سریع نمونه
• دمای -20 یا بالاتر: دمای مناسب ذخیره سازی نمونه یا RNA دمای -80 به پایین میباشد. مثل فریزر-80 و نیتروژن مایع

جلوگیری از تخریب آنزیمی حین استخراج

عدم حضور RNase، کاهش دما به منظور کاهش فعالیت آنزیم های موجود، مهار کننده این واکنش هستند. استفاده از میکروتیوب، سرسمپلر، محلول های RNase Free، محیط بسته و بدون گردش هوا آلوده( استفاده از هود لامینار)، استفاده از دستکش، روپوش و ماسک و… حین استخراج مانع ورود این آنزیم به RNA میشود.فعالیت بخش کمی از آنزیم وارد شده نیز با کاهش دمای استخراج از جمله کارکردن بر روی یخ، استفاده از سانتریفیوژ یخچالدار کاهش پیدا کرده و مانع تجزیه آنزیمی میشود.

شرایط نگهداری RNA

• تبدیل بلافاصله به cDNA
• نگهداری در آب DEPC Treated
• نگهداری در TE Buffer pH8
• فریز کردن در دمای کمتر از -80
• عدم فریز و دفریز متعدد

مثالی از RNA سالم و تخریب شده. چاهک سمت چپ Ladder | چاهک وسط نمونه RNA تخریب شده: که RNA های تخریب شده در پایین ژل تجمع پیدا کرده| چاهک سمت راست RNA سالم که باندهای 28S، 18S و 5S rRNA یوکاریوتی به خوبی دیده میشود .

نتیجه گیری

حفظ یکپارچگی و کیفیت RNA یکی از مهم‌ترین پیش‌نیازهای دستیابی به نتایج دقیق و قابل اعتماد در مطالعات تحقیقاتی و آزمایش‌های تشخیصی مبتنی بر RNA است. از آنجا که تخریب RNA می‌تواند در مراحل مختلف از نمونه‌گیری تا استخراج، نگهداری و انجام آزمایش رخ دهد، کنترل عوامل مؤثر بر تخریب فیزیکی، شیمیایی و به‌ویژه آنزیمی آن ضروری است. تخریب RNA، خصوصاً در مولکول‌های mRNA با طول زیاد، منجر به کاهش کیفیت سنتز cDNA و بروز خطا در آنالیز بیان ژن می‌شود. بنابراین رعایت اصول نمونه‌گیری صحیح، جلوگیری از آلودگی به RNase، استفاده از شرایط دمایی مناسب، به‌کارگیری مواد و تجهیزات RNase-Free و ذخیره‌سازی صحیح RNA در دماهای بسیار پایین، نقش تعیین‌کننده‌ای در حفظ یکپارچگی این مولکول حساس دارد. در نهایت، توجه به تمامی این ملاحظات موجب افزایش دقت، تکرارپذیری و اعتبار نتایج حاصل از آزمایش‌های مولکولی خواهد شد.

شرکت دانش بنیان راتین ژن، تولید کننده محصولات بیولوژی مولکولی از جمله ترایزول، انواع کیت استخراج RNA و DNA، کیت Poly(A) Polymerase، آنزیم Reverse Transcriptase، کیت سنتز cDNA و… که جهت کسب اطلاعات بیشتر، میتوانید به بخش محصولات مراجعه فرمایید.

Technogene

نوآوری در تولید، ضمانت در کیفیت