فنل اشباع | کاربرد مولکولی، نحوه ساخت و بافر های مورد نیاز
فنل ترکیبی آروماتیک با فرمول شیمیایی C6H5OH است. این ترکیب به واسطه گروه هیدروکسیل ، امکان واکنش با پروتئین را داشته که موجب دناتوره کردن و جداسازی آن از DNA و RNA در فرایند استخراج میشود.
علت اشباع کردن فنل
از آنجایی که فنل اشباع در استخراج RNA، DNA در محلول ترایزول استفاده میشود، حفظ شرایط بافری و pH در طول فرایند از اهمیت بالایی برخوردار است. شرایط بافری و pH حین حل شدن فنل کریستالی در آب ناپایدار بوده، در نتیجه قبل از استفاده باید در بافر مورد نیاز حل شود و پس از به ثبات رسیدن مورد استفاده قرار گیرد. همچنین مولکول های فنل بخشی از مولکول های آب را به خود جذب میکند، در صورت استفاده مستقیم در ترایزول و استخراج RNA، آب سوپرناتانت کاهش پیدا کرده و حجم آن کاهش پیدا میکند.
PH فنل اشباع
از آنجایی که PH محلول لیزات در استخراج RNA و DNA و جداسازی این دو از هم نقش مهمی دارد، بسته به هدف استفاده، pH محلول فنول اشباع تنظیم میشود.
PH برای استخراج RNA
از آنجایی که DNA در pH اسیدی انحلال پذیری کمتری دارد، اگر هدف استخراجRNA باشد، PH را حدود 4-4.5 تنظیم میکنیم. بدین منظور اشباع سازی در آب مقطر انجام میشود، که در نهایت PH محلول در همین بازه نگه داشته میشود. در PH اسیدی، RNA در فاز رویی محلول باقی مانده اما DNA با سانتریفیوژ به فاز زیرین انتقال مییابد.
PH در استخراج DNA
اگر هدف استخراج DNA باشد، PH را در محدوده 7.5-8 با استفاده از نمک Tris-HCL تنظیم میکنیم. در این PH، دئوکسی ریبونوکئیک اسید (DNA) در فاز بالایی در کنار RNA قرار میگیرد.
نحوه اشباع سازی
*نکته بسیار مهم: فنل یکی از مواد سمی بوده و رعایت موارد ایمنی از اهمیت بالایی برخوردار است. استفاده از روپوش، دستکش، ماسک و عینک ایمنی از موارد الزامی بوده و فرایند را زیر هود شیمیایی با دور بالای فن انجام دهید.
* کریستال فنل رنگ سفید شفاف دارد، اما در صورت اکسید شدن رنگ صورتی پیدا میکند، که استفاده از آن توصیه نمیشود.
Water Saturated Phenol
از آنجایی که این نوع اشباع سازی با هدف استخراج RNA انجام میشود، باید تمامی ظروف و مواد RNase Free باشند.
مقداری از پودر را در ظرف ریخته و در دمای 50-60 درجه ذوب کنید. سپس مقداری آب DEPC Treated را به فنل ذوب شده اضافه کرده و به مدت 20 دقیقه هم بزنید. پس از آن محلول را در دمای محیط یا یخچال گذاشته تا سرد شود. در این مرحله محلول دوفازی ایجاد میشود که فاز زیرین هدف ما است. با پیپت به آرامی محلول زیری را برداشته و به ظرف جدید انتقال دهید. در این مرحله ممکن است لایه ای شیری رنگ نیز بین دو فاز دیده شود، این لایه احتمالا ناخالصی بوده و از آن برندارید.
این فرایند را یک یا دو مرتبه دیگر تکرار کنید و در نهایت لایه زیرین که همان فنل اشباع است را جدا کرده و در ظرف تیره نگهداری کنید.
اشباع سازی در بافر Tris
در صورتی که هدف استخراج DNA باشد، از بافر Tris-HCL با PH~8 استفاده میشود. ابتدا مقداری از فنل را در دمای 50-60 درجه ذوب کنید. سپس مقداری بافر Tris-HCL 0.5M با PH~8 به فنل ذوب شده اضافه و 20 دقیقه در همان دما هم بزنید. سپس سرد کرده تا دوفاز ایجاد شود. لایه زیرین را به ظرف جدید انتقال و این فرایند را 2-3 مرتبه تکرار کنید. برای مرحله آخر به جای بافر 0.5 مولار تریس، 0.1 مولار از این نمک را اضافه کنید . تا در نهایت فنل اشباع در 0.1M Tris-HCL بدست آید.
شریط نگهداری فنل اشباع
- فنل اشباع به نور حساس بوده و باید در ظرف تیره نگهداری شود.
- دمای نگهداری: 4-8 درجه سانتی گراد
- به منظور جلوگیری از اکسیداسیون، درب ظرف بسته باشد
- همچنین افزودن 0.1 درصد هیدروکسی کوئینولین (8-hydroxyquinoline) به فنل اشباع باعث افزایش پایداری آن میشود.
آیا استفاده از فنل اشباع منسوخ نشده؟
علارغم سمی بودن فنل، اما به علت قدرت دناتوره کنندگی بالای پروتئین و کارایی بالا در استخراج RNA و DNA همچنان در آزمایشگاه های زیادی با رعایت موارد ایمنی مورد استفاده قرار میگیرد.
در صورت تماس با پوست یا چشم چکار باید انجام داد؟
بلافاصله با آب فراوان شستشو داده شود.
فنل اشباع چه مزیتی نسبت به کیت های استخراج دارد؟
هزینه کمتر، بازدهی بالا و امکان استفاده در حجم های بالا از مزایای این روش نسبت به سایر روش ها میباشد.
آیا فنل اشباع در استخراج پلاسمید هم استفاده میشود؟
بله، امکان استفاده فنل اشباع در استخراج انواع اسید نوکلئیک وجود دارد که باید شرایط بافری مناسب هر کدام مهیا شود . همچنین در پاک کردن آنزیم هایی مثل آنزیم های محدودالاثر، Poly(A) Polymeraseو… بعد از انجام فعالیت خود به منظور خالص سازی DNA یا RNA تحت تاثیر آنزیم قرار گرفته شده، استفاده میشود.
