4 روش رایج حذف یا غیر فعال سازی آنزیم پس از فعالیت

در بسیاری از پروتکل های استفاده از آنزیم، در مرحله آخر، غیرفعال سازی یا حذف آنزیم نوشته شده است. این موضوع به این علت است که حضور آنزیم فعال در مراحل بعدی موجب اختلال در فعالیت آنزیم های بعدی، تخریب محصول واکنش بعد، مصرف سوبسترای واکنش بعد و… می‌شود.

غیر فعال سازی Restriction Enzyme

یکی از کاربرد های این آنزیم ها، برش قطعه هدف در پروژه های کلونینگ ژن می‌باشد. تصور کنید این آنزیم همچنان در محیط واکنش DNA T4 Ligase که یکی از مراحل بعدی کلونینگ ژن است وجود دارد، T4 Ligase اتصال داده، آنزیم محدودالاثر دوباره برش میدهد! در نتیجه باید این آنزیم پس از فعالیتش غیر فعال شود که اصلی ترین راه آن حرارت دادن است که موجب دناتوره کردن آنزیم می‌شود.

غیرفعال سازی DNase1 پس از حذف آلودگی DNA ژنومیک

در پروژه های بررسی بیان ژن، به علت امکان اتصال پرایمر های ریل تایم PCR، به DNA ژنومیک، موجب تکثیر غیر اختصاصی و اختلال در بررسی بیان ژن می‌شود. در نتیجه باید DNA را توسط آنزیم DNase حذف کرد. اما از آنجایی که نمونه DNase Treated شده پس از آن برای سنتز cDNA استفاده میشود، حضور آنزیم فعال، محصول آنزیم Reverse Transcriptase را تخریب میکند. که از راه های غیر فعال سازی یا حذف این آنزیم، حرارت، افزودن EDTA، استفاده از کیت تخلیص و… می‌باشد.

EDTA چگونه باعث مهار واکنش DNase میشود؟

EDTA (اتیلن‌دی‌آمین تترااستیک اسید) شلاته کننده یون های 2 ظرفیتی است که یون های Ca Mg و… را جذب کرده و از دسترس آنزیم ها خارج میکند. آنزیم DNase1 به یون های کلسیم و منیزیم به عنوان کوفاکتور نیاز داشته و در صورت عدم حضور، فعالیت آنزیم مهار می‌شود.

غیرفعال سازی پروتئیناز K پس از استخراج اسید نوکلئیک

Proteinase K سرین پروتئازی است که موجب تخریب ساختار پروتئین شده و در دناتوره کردن پروتئین ها و جدا کردن هیستون از DNA در استخراج نقش دارد. در صورت حضور آنزیم فعال در میکس آنزیمی ، آنزیم های Taq Polymeraset، Reverse Transcriptaseو… را غیر فعال می‌کند. استخراج مطلوب با شستشو کامل این آنزیم یکی از نکات کلیدی استخراج اسید نوکلئیک میباشد اما در صورت وجود آن، خالص سازی توسط فنل-کلروفرم، حرارت 95 از راه های حذف یا غیرفعال سازی آن است.

حذف یا غیر فعال سازی Poly (A) Polymerase

آنزیم Poly(A) Polymerase با فعالیت پلی آدنیلاسیونی، نوکئوتید A را به سر 3′ رشته ریبونوکلئیک اسید یا دئوکسی ریبونوکلئیک اسید اضافه می‌کند. یکی از کاربردهای این آنزیم، بررسی بیان microRNA است. از آنجایی که پس از پلی آدنیلاسیون RNA، سنتز cDNA در حضور پرایمر RT Adaptor انجام میشود و این آنزیم علاوه بر اتصال A به RNA، توان اتصال باز A به پرایمر را نیز دارد، در صورت حضور آنزیم فعال در میکس سنتز cDNA، پرایمر ها قبل از اتصال به دم پلی A، خود نیز پلی آدنیله شده و با ایجاد تغییر در سر 3’، از واکنش سنتز cDNA خارج می‌شوند. در نتیجه حذف یا غیر فعال سازی این آنزیم پس از پلی آدنیلاسیون از مراحل مهم بررسی بیان microRNA است.

راه های غیر فعال سازی یا حذف PAP Enzyme

• خالص سازی توسط فنل-کلروفرم: محصول حاصل از پلی آدنیلاسیون توسط فنل- کلروفرم، مشابه استخراج توسط ترایزول، با پروتکل رسوبی، حذف میشود.
• افزودن EDTA با غلظت نهایی 10mM
• حرارت 80 درجه به مدت 10 دقیقه: اما به علت احتمال تخریب RNA توسط حرارت، این روش توصیه نمی‌شود.

روش های رایج حذف یا غیر فعال سازی آنزیم ها

• غیرفعال سازی حرارتی: یکی از راحتترین و متداولترین راه های غیر فعال سازی است که اکثر آنزیم هایی که با DNA در ارتباط هستند با این روش غیرفعال می‌شوند.
• حذف با فنل-کلروفرم
• خالص سازی توسط روش ستونی: توسط محلول لیز کننده آنزیم غیرفعال شده و سپس توسط چندین مرحله شستشو، حذف میشود.
• استفاده از مهار کننده اختصاصی: به عنوان مثال، مهار RNase توسط RNase inhibitor

جمع بندی

آنزیم‌ها در بسیاری از فرآیندهای زیست‌شناسی مولکولی از اجزای بسیار مهم هستند. اما برای جلوگیری از اختلال در واکنش ها، باید فعالیت آنها در زمان مناسب متوقف شود. اگر آنزیم‌ها را درست حذف کنیم یا از کار بیاندازیم، از بروز واکنش‌های ناخواسته جلوگیری کرده و کیفیت نتایج نهایی را بهبود می‌بخشیم. برای انتخاب روش حذف آنزیم، باید به نوع آنزیم، حساسیت مراحل بعدی و نیازهای آزمایش توجه کنیم که در بروشور اکثر آنزیم ها، روش های حذف یا غیرفعال سازی آن نوشته شده است.

کیت Poly (A) Polymerae

برند Technogene