سنتز cDNA چیست؟ آموزش مرحلهبهمرحله سنتز cDNA برای بررسی بیان ژن
راهنمای جامع سنتز cDNA برای بررسی بیان ژن
مقدمه
سنتز cDNA یکی از مراحل اصلی در فرایند بررسی بیان ژن با استفاده از تکنیک Real_Time PCR میباشد. در این فرآیند، RNA به کمک آنزیم ترانسکریپتاز معکوس (RT) به cDNA تبدیل میشود. انتخاب صحیح آنزیم، پرایمر و شرایط واکنش تأثیر مستقیمی بر دقت و بازدهی این واکنش دارد. در این مقاله، علاوه بر بررسی انواع آنزیمهای RT و پرایمرهای مورد استفاده، یک پروتکل استاندارد برای سنتز cDNA به همراه نکات کلیدی و راهکارهای رفع مشکلات رایج ارائه شده است
انتخاب آنزیم ترنسکریپتاز معکوس(RT) مناسب
انواع رایج آنزیم RT
- M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus RT)
این آنزیم دارای فعالیت RNAse H ضعیف، دمای کاری ۴۲-۵۰ درجه سانتیگراد میباشد که مناسب برای سنتز cDNA بلند و دارای حساسیت کم به مهارکنندهها است
- نسل های بهینه شده از M-MLV
با ایجاد جهش های ژنتیکی خودخواسته، علاوه بر افزایش سرعت آنزیم و پایداری دمایی بالاتر(پایداری دمایی تا ۵۵ درجه) ، فعالیت بخش RNAse H به حداقل خود رسیده تا امکان سنتز CDNA از قطعات بلندتر را فراهم آورد و همچنین به علت افزایش دمای عملکردی آنزیم امکان سنتز قطعات RNA با ساختار های ثانویه پیچیده را نیز تسهیل کرده است
انتخاب پرایمر مناسب برای سنتز cDNA
انتخاب پرایمر مناسب تأثیر مستقیمی بر دقت و بازدهی cDNA دارد.
Oligo(dT)
این پرایمر به دم پلیآدنین (poly-A) در انتهای 3′ RNA متصل شده و برای سنتز CDNA از mRNA مناسب میباشد
Random Hexamer
توالیهای تصادفی ۶ نوکلئوتیدی که جهت تولید cDNA از کل RNA سلولی مناسب میباشد، از این پرایمر معمولا جهت تبدیل RNA ویروسی به CDNA در فرایند تشخیص عفونت به RNA Viruses به کمک تست RT_PCR استفاده میشود
Gene-Specific (GSPs)
در صورتی که نیاز به سنتز CDNA از ناحیه خاصی از یک ژن خاص را دارید میتوانید از پرایمر اختصاصی طراحی شده برای ناحیه مورد هدف استفاده کنید (به عنوان مثال میتوانید یکی از پرایمر های ریل تایم PCR که مکمل رشته RNA میباشد نیز استفاده کنید)
پرایمر مخصوص microRNA
در این خصوص دو روش سنتز وجود دارد که به طور خلاصه یکی از روش ها استفاده از پرایمر با ساختار حلقوی که انتهای 3′ این پرایمر آزاد بوده و مکمل حدود 6 نوکلئوتید از قسمت 3′ میکرو RNA بوده، میباشد که نیاز به طراحی اختصاصی برای هر microRNA میباشد، بدین معنی که برای بررسی بیان هر microRNA, نیاز به سنتز cDNA جداگانه میباشد
روش دوم استفاده از پرایمر بلندی که علاوه بر قسمت backbone که مشابه ساختار حلقوی در پرایمر قبلی عمل میکند، دارای توالی 12_18 نوکلئوتیدی T جهت اتصال به توالی Poly A اضافه شده به سر 3′ microRNA میباشد( در این فرایند ابتدا تمامی microRNA ها توسط آنزیم Poly(A) Polymerase پلی آدنیله شده و سپس در یک مرحله تمامی microRNA ها با پرایمر طراحی شده به cDNA تبدیل کرد, بدین معنی که نیاز به مراحل جداگانه سنتز cDNA برای هر microRNA نیست) این نوع واکنش در مطلب جداگانه ای توضیح داده میشود
پروتکل عملی سنتزcDNA
1. بررسی RNA
RNA را در ژل آگارز ۱٪ الکتروفورز کنید و با مشاهده باند های rRNA از عدم تخریب RNA اطمینان حاصل کنید
2. حذف DNA ژنومی
در صورتی که از ترایزول و یا کیت استخراج بهینه استفاده کنید، نیازی به این مرحله وجود ندارد اما در صورت مشاهده باند DNA در الکتروفورز، به منظور حذف آن میتوان از پروتکل زیر استفاده کرد
مثالی از واکنش DNase
| ماده | حجم |
| RNA (100-1000 ng) | 8 میکرولیتر |
| DNase I (1 U/µL) | 1 میکرولیتر |
| DNase Buffer (10X) | 1 میکرولیتر |
شرایط انکوباسیون:
- انکوباسیون در دمای۳۷درجه سانتیگراد به مدت ۱۰ دقیقه
- منظورغیرفعالسازی DNase با گرما: انکوباسیون در دمای80 درجه به مدت ۱۰ دقیقه
سنتز cDNA
| ماده | مقدار |
| RNA حاصل از واکنش قبل(DNase Treated) RNA خالص اولیه | 10 میکرولیتر 100-1000نانوگرم |
| بافر اختصاصی آنزیم RT RT Buffer 10x | 2 microliter |
| dNTP(40mM) | 2 میکرولیتر |
| پرایمر(الیگو dT، رندوم هگزامر، اختصاصی ژن) 10μM | 1 میکرولیتر |
| RT Enzyme | 2 میکرولیتر |
رساندن به حجم نهایی 20میکرولیتر توسط آب فاقد نوکلئاز
برنامه انکوباسیون:
در صورت استفاده از پرایمر های رندوم هگزامر و یا اختصاصی ژن، به منظور اتصال پرایمر، میتوان در دمای 25 درجه به مدت 10 دقیقه انکولاسیون کرد اما در صورت استفاده از الیگو dT نیاز به این مرحله نیست
- 42-60 C° به مدت 30-60 دقیقه ( بسته به نوع آنزیم)
- 85 C° به مدت 5 دقیقه( با هدف غیرفعال سازی آنزیم)
- روی یخ قرار دهید یا در دمای 20- ذخیره کنید.
نکات مهم و بهینهسازیها
- RNAخالص و بدون آلودگی DNA ژنومی استفاده کنید.
- به منظور جلوگیری از تخریب RNA میتوانید به نمونه RNA، پروتئین RNase Inhibitor بزنید.
- برای RNAهای با ساختار پیچیده از آنزیم RT مقاوم به حرارت استفاده کنید تا با افزایش دمای مرحله سنتز، ساختارهای ثانویه باز شده و دسترسی آنزیم بیشتر شود.
- پرایمر مناسب را بسته به نوع RNA هدف انتخاب کنید.
مشکلات رایج (Troubleshooting) و راهحلها
1. بازده پایین cDNA
علت: کیفیت پایین RNA، دمای نامناسب، وجود مهارکنندهها
راهحل: بررسی کیفیت RNA، افزایش دما برای RNAهای دارای ساختارهای ثانویه، استفاده از RNase Inhibitor
2. آلودگی به DNA ژنومی
علت: حذف ناکامل DNA ژنومی
راهحل: استفاده از DNase قبل از RT، طراحی پرایمرهای اختصاصی برای exon-exon junction، در صورت استفاده از TRIzol و کیت استخراج بهینه، این مشکل تا حد بسیار زیادی برطرف می شود
3. سیگنال ضعیف در qPCR
علت: بازده پایین سنتز cDNA، مقدار ناکافی RNA
راهحل:افزایش مقدار RNA اولیه، بهینهسازی واکنش
جمع بندی
سنتز cDNA یک مرحله کلیدی در مطالعات بیان ژن است که نیازمند دقت بالا در انتخاب آنزیم، پرایمر و شرایط واکنش است. رعایت پروتکل استاندارد و توجه به نکات بهینهسازی باعث افزایش دقت و بازدهی این فرآیند میشود. در نهایت، کنترل کیفیت RNA و استفاده از کیت و محلول های استاندارد استخراج RNA از عوامل کلیدی در موفقیت این فرآیند محسوب میشوند.
آیا نیاز به مشاوره تخصصی در سنتز cDNA دارید؟ تیم ما در شرکت دانش بنیان راتین ژن آماده ارائه مشاوره و تولید آنزیمها و معرفهای مورد نیاز شما می باشد. برای دریافت اطلاعات بیشتر با ما در ارتباط باشید.
سوالات متداول(FAQ)
آیا راهی هست که سنتز cDNA انجام شده را قبل از ریل تایم PCR بررسی کرد؟
تست یا آزمایش خاصی که به راحتی کیفیت cDNA را بسنجد در دسترس نیست، اما با اطمینان از نمونه RNA، استفاده از کیت سنتز cDNA با کیفیت و مطمئن، میتوان از انجام این مرحله اطمینان حاصل کرد.
آیا مقادیر آنزیم و بافر استفاه شده در همه کیت ها یکسان است؟
خیر، بسته به مقدار یا غلظت آنزیم و بافر، هر تولید کننده پروتکل خاصی را در بروشور کیت ارائه میدهد که باید طبق آن پیش رفت.
آنزیم Reverse Transcriptase چیست؟
این آنزیم با منشا ویروسی است که در ویروس های با ژنوم RNA جهت تبدیل آن به DNA برای گنجاندن ژنوم خود در ژنوم میزان استفاده میشود. که ما در پروژه های بررسی RNA و در مرحله سنتز cDNA از آن استفاده میکنیم.
تفاوت Oligo dT و رندوم هگزامر چیست؟
الیگو dt پرایمر با طول 18-20 باز( اکثر مواقع) است که به ناحیه Poly (A) متصل میشود که در mRNA یا RNA های پلی آدنیله شده وجود دارد. Random Hexamer توالی 6 نوکلئوتیدی است که به صورت رندوم و تصادفی از نوکلئوتید های A, T, C, G تشکیل شده که به صورت رندوم به بخش های مختلف RNA متصل میشود که بیشتر برای RNAژنومیک ویروسی کاربرد دارد.
چرا قبل از سنتز cDNA باید DNA ژنومیک را حذف کنیم؟
از آنجا که هدف ما، در پروژه های بررسی بیان ژن، میزان RNA است و ممکن است پرایمر های RT-qPCR علاوه بر cDNA که از روی الگو RNA ساخته شده، به DNA ژنومیک نیز متصل و موجب خطا در بررسی شود، قبل از شروع آن را حذف میکنیم
مقدار RNA جهت سنتز cDNA چقدر است؟
این مقدار به میزان زیادی به آنزیم RT و کیت سنتز cDNA بستگی دارد که در پروتکل کیت، مقدار آن، از کمترین مقدار ممکن تا بیشترین مقدار، گزارش شده است. اما در اکثر پروژه های بررسی بیان ژن، جهت نرمال سازی مقدار RNAدر تمامی نمونه ها، 1000 نانوگرم RNA توتال استفاده میشود.
نمونه cDNA سنتز شده را کجا نگهداری کنیم؟
توصیه میشود هر چه سریعتر استفاده شود. اما امکان نگهداری Overnight در دمای 4 درجه ، 1 هفته در دمای -20 وجود دارد.
آیا میتوان چند نوع پرایمر را همزمان استفاده کرد؟
بله، میتوان از چند نوع پرایمر بهصورت همزمان استفاده کرد. برای مثال، ترکیب Oligo(dT) و Random Hexamer باعث افزایش پوشش رونویسی و سنتز cDNA از طیف گستردهتری از RNAها میشود.