نحوه ساخت بافر TBE

بافر TBE (Tris-Burate-EDTA) محلولی کاربردی در تکنیک های مولکولی، جهت الکتروفورز نمونه DNA و RNA می باشد که با استفاده از آن شرایط بافری جهت جدا سازی قطعات بر اساس اندازه از یکدیگر فراهم میشود.

ترکیبات TBE

ترکیبات این بافر نمک Tris base, بوریک‌اسید و EDTA اتیلن دی آمین تترااستیک اسید بوده که هر کدام نقشی در جداسازی قطعات اسید نوکلئیک در ژل آگارز ایفا میکنند

نقش Tris base در بافر TBE

یکی از شرایط مورد نیاز حرکت قطعات DNA و RNA در طول ژل، حفظ بار منفی قطعات بوده که وابستگی زیادی به ph محیط دارد. نمک Tris base با حفظ Ph محیط در محدوده قلیایی 8-8.3، باعث ثبات بار قطعات و حرکت پیوسته آنها در طول ژل میشود. لازم به ذکر است علاوه بر Tris-base, Tris-HCl نیز وجود داشته که به علت تنظیم ph در محدوده اسیدی، نباید در ساخت این محلول استفاده شود

نقش boric acid

جهت حفظ ph در یک محدوده، همکاری یک باز و اسید مورد نیاز بوده که بافر تریس-بورات یکی از بافر های قدرتمند حفظ ph در ولتاژ مورد استفاده در الکتروفورز میباشد و بوریک

نقش EDTAدر بافر TBE

از انجایی که حفظ قطعات اسید نوکلئیک از تجزیه توسط آنزیم ها در طول فرایند الکتروفورز یکی از اصل های اساسی است، مهار این آنزیم ها توسط حذف یون های دو ظرفیتی از جمله کلسیم و‌منیزیم مورد نیاز برای فعالیت این آنزیم ها توسط EDTA که شلاته کننده این یونها است انجام‌میشود

غلظت نهایی نمک ها در بافر TBE

فرمول TBE 10X

جهت ساخت محلول ذخیره 10X:

0.89 مولار بوریک اسید، 0.89 مولار تریسHCl و 20 میلی مولار EDTA

فرمول بافر TBE 1X

جهت تهیه این غلظت، محلول ذخیره را به نسبت 1با 9 حجم آب مقطر مخلوط کنید که غلظت های نهایی 89میلی مولار بوریک اسید، 89 میلی مولار Tris-HCl و 2 میلی مولار EDTA میشود.

نحوه تهیه بافر TBE

از آنجایی که نمک EDTA انحلال پذیری کمتری نسبت به سایر اجزا دارد، باید ابتدا این نمک را به صورت جداگانه محلول کرد. بدین صورت که ابتدا غلظت 0.5 مولار از آنرا در حضور NaOH ساخته و به PH8 میرسانیم.سپس متناسب با حجم مورد نیاز از بافر TBE، مقادیر لازم از Tris و بورات را ریخته سپس با توجه به فرمول C1V1=C2V2 حجمی از استوک EDTA را برداشته که در نهایت با رقیق سازی در کنار سایر اجزا به غلظت نهایی 0.89 مولار و یا 89 میلی مولار برسد در نهایت Ph محلول را به محدوده 8تا 8.3 برسانید. همچنین میتوانید مقادیر خشک مواد را با یکدیگر مخلوط کرده و به حجم نهایی برسانید اما ممکن است حل شدن EDTA به آرامی اتفاق بیوفتد.

محاسبه مقادیر مورد نیاز در ساخت بافر TBE

جهت راحتی محاسبات مورد نیاز میتوانید با مراجعه به صفحه طراحی شده توسط تیم راتین ژن، به راحتی مقادیر مورد نیاز غلظت های 1X,5X,10X را بدست آورید

جهت انتقال کلیک کنید.