آنزیم RT (ترنسکریپتاز معکوس) و نقش آن در سنتز cDNA
آنزیم RT چیست؟
آنزیم Reverse Transcriptase یک آنزیم رونویسی کننده است که به صورت طبیعی در RNA Viruses بیان شده و موجب تبدیل RNA ژنومیک به DNA شود. از آنجایی که RNA یکی از مولکول های زیستی مهم در بررسی های ژنتیکی و بیماری هاست، تبدیل این مولکول حساس به DNA اهمیت زیادی دارد. آنزیم های نوترکیب برگرفته شده از منشا ویروسی این آنزیم، کاربرد های زیادی در علم ژنتیک دارد.
مکانیسم عملکرد ریورس ترنسکریپتاز
این آنزیم با الگو قرار دادن تک رشته RNA و با استفاده از یک آغازگر حاوی انتهای 3′ OH آزاد، باز های آلی dNTP(dATP, dTTP, dCTP, dGTP) را به رشته مکمل اضافه میکند. این آنزیم با دارا بودن دو دومن اصل ترنسکریپتاز و ریبونوکلئاز، رشته RNA اولیه را گرفته، نوکلئوتید های مکمل را بر اساس توالی رشته الگو به رشته مکمل اضافه میکند. دومن RNase H یکی از بخش های اصلی در فولدین و شکل گیری آنزیم میباشد که پس از سنتز رشته مکمل، رشته الگو که RNA است را تجزیه میکند.
تبدیل RNA به cDNA
اجزای واکنش سنتز cDNA
- آنزیم Reverse Transcriptase
- بافر اختصاصی جهت حفظ pH و تامین یون های مورد نیاز فعالیت آنزیم
- dNTP به عنوان آجر های ساخت دیواره cDNA
- پرایمر به عنوان دستگیره شروع واکنش، با تامین 3’OH آزاد
- RNA الگو
نقش پرایمر در شروع واکنش
آنزیم RT به تنهایی نمیتواند سنتز cDNA را آغاز کند. پرایمر که یک توالی کوتاه نوکلئوتیدی است به RNA هدف متصل شده و 3’OH آزاد را تامین میکند.
انواع پرایمر مورد استفاده در سنتز cDNA
- الیگوdT یا Oligo(dT): این پرایمر به توالی پلیA متصل میشود. یکی از توالی های دارای Poly(A)، رشته mRNA یوکاریوتی است که در انتهای 3′ خود دم پلی آدنین را دارد.
- رندوم هگزامر( Random Hexamer): توالی های 6 نوکلئوتیدی تصادفی هستند که به صورت رندوم به بخش های مختلف RNA متصل میشوند. اتصال به بخش های مختلف باعث ایجاد نواحی های متعدد شروع سنتز در طول توالی میشود. این نوع پرایمر بیشتر در تبدیل RNAژنومیک ویروس ها به cDNA در تشخیص عفونت های ویروسی کاربرد دارد.
- Gene Specific Primer: جهت تبدیل قطعه خاصی از یک RNA به cDNA استفاده میشود. به عنوان مثال میتوان یکی از پرایمر های فروارد یا ریورس طراحی شده ریل تایم PCR را استفاده کرد.
انواع آنزیم Reverse Transcriptase
در بررسی های آزمایشگاهی، انواعی از این آنزیم با منشا های ویروسی مورد استفاده قرار میگیرد:
AMV Reverse Transcriptase
از ویروس ایجاد کننده لوسمی پرندگان منشا گرفته شده . یکی از اولین آنزیم های RT تجاری میباشد که پایداری دمایی 42-50درجه سانتی گراد داشته و فعالیت دومن RNase H بالایی دارد.
M-MuLV Reverse Transcriptase
این آنزیم از Molony Murine Leukemia Virus گرفته شده است که نسبت به آنزیم قبل، پایداری حرارتی کمتری، اما راندمان سنتز cDNA از توالی های بلند بیشتری دارد. یکی از آنزیم های مرجع آزمایشگاهی میباشد.
RNase H Minus M-MLV
این آنزیم با ایجاد جهش هایی در دامین RNase H آنزیم، بدون تاثیر در فعالیت پلیمرازی آنزیم، ایجاد شده که فعالیت نوکئازی کاهش پیدا کرده است. کاهش فعالیت این بخش، موجب جلوگیری از تجزیه قطعه RNA الگو حین سنتز cDNA شده که راندمان سنتز را افزایش میدهد.
نسخه های دارای تغییرات مهندسی بیشتر
میتوان با ایجاد جهش هایی در توالی پروتئینی آنزیم، افزودن یا کم کردن توالی هایی به آنزیم و… نسخه هایی از آنزیم را ایجاد که فعالیت پلیمرازی بیشتر، پایداری حرارتی بیشتر، فعالیت RNase H کمترو راندمان بیشتر سنتز از قطعات بلند ، داشته باشد.
ویژگی های یک آنزیم RT خوب چیست؟
با پیشرفت علم، رفته رفته آنزیم هایی طراحی و تولید میشود که راندمان سنتز بیشتر از قطعات بلند، پایداری دمایی بیشتری داشته که انتخاب این آنزیم ها بسته به هدف، اهمیت بالایی دارد
پایداری حرارتی بالاتر
رشته RNA الگو ممکن است پیچ وتاب و ساختار های ثانویه متعددی داشته باشد. Hairpin و Loop ها موجب پیچ وتاب RNA میشود. این پیچ و تاب مانع دسترسی راحت پرایمر ها و آنزیم به رشته RNA شده و سرعت عمل سنتز با کاهش میدهد. به منظور باز کردن این ساختار ها، افزایش دما یکی از راه حلها است. اما افزایش دما نباید به حدی باشد که آنزیم را دناتوره کرده و فعالیت سنتز را کاهش دهد. از این رو هر چه پایداری دمایی آنزیم بیشتر باشد، امکان افزایش دمای بیشتری میسر شده، در نتیجه رشته RNA بیشتر باز میشود.
راندمان سنتز بیشتر
از آنجایی که سنتز cDNA از انتهای 3′ رشته mRNA آغاز میشود و به سمت انتهای دیگر ادامه پیدا میکند، در صورت اینکه هدف مطالعه ما بخش های بالاتر نزدیک به سر 5′ باشد، باید تمامی رشته RNA به صورت یکپارچه به cDNA تبدیل شود. آنزیم های اولیه به علت سرعت پلیمرازی پایین و پایداری فعالیتی کمتر، امکان سنتز توالی های بلند را نداشته و رشته RNA را از نیمه رها میکردند. این امر موجب عدم سنتز بخش های بالاتر به CDNA شده و الگویی برای بررسی های بعدی ایجاد نمیشود. به همین دلیل نیاز به ایجاد آنزیم های با راندمان سنتز بالاتر ایجاد شد.
فعالیت RNase H کمتر
در حین فعالیت DNA Polymerase دومن Reverse Transcriptase، فعالیت دومن RNase H موجب برگشت آنزیم به عقب و تجزیه رشته RNA الگو میشود. این برگشت به عقب سرعت پلیمرازی آنزیم را کاهش داده در نتیجه راندمان سنتز نیز کاهش پیدا میکند. از این رو نیاز به آنزیم هایی با کاهش بیشتر فعالیت این بخش نوکئازی پررنگ شد.
عوامل مهم موثر بر کیفیت سنتز cDNA
همانطور که گفته شد، با افزایش بیشتر دمای مرحله سنتز، رشته های RNA بهتر در دسترس آنزیم قرار گرفته و با اطمینان بیشتری کل رشته های RNA به cDNA تبدیل میشود. همچنین با کاهش فعالیت دومن نوکلئازی، وقت و انرژی آنزیم کمتر صرف فعالیت ناخواسته میشود. در نتیجه بخش زیادی از کیفیت سنتز cDNA به فعالیت آنزیم RT بستگی دارد .
از آنجایی که قصد ما در پروژه های بررسی بیان ژن، میزان بیان یک mRNA خاص در سلول میباشد، تبدیل تمامی قطعات RNA به طول کامل و یکپارچه به cDNA اهمیت بسیار بالایی داد.
سنتز ناقص از یک RNA بلند
به عنوان مثال، ممکن است یک رشتهmRNA طول 8000 بازی داشته باشد. هدف ما بررسی اگزون شماره 2 mRNA است. اگزون شماره 2 از محل شروع سنتز که انتهای 3′ است فاصله 6000 بازی دارد. حال تصور کنید آنزیم RT سنتز را شروع کرده اما از وسط کار جدا شده و از انتها3′ فقط 5000 باز را به cDNA تبدیل کرده و بقیه RNA بدون الگو باقی میماند. در تست Real Time PCR، پرایمر ها برای اگزون 2 طراحی شده اما الگوی بسیار کمی برای اتصال پرایمر ایجاد شده است. واکنش تکثیر به خوبی انجام نشده، یا Ct بالاتری نسبت به واقعیت نمایش داده میشود.
مشکلات سنتز cDNA ناقص
با پیش آمدن مشکل بیان شده در بالا، یا Ct بالای تست RT-qPCR، به اشتباه بیان پایین ژن تلقی میشود. یا عدم تکثیر خوب، موجب شک به فرایند استخراج RNA، طراحی پرایمرهای PCR، ستاپ واکنش PCR و… شده اما مشکل جای دیگریست. وقت و هزینه زیادی صرف انجام یک پروژه ساده میشود.
آنزیم HyperTherm SynFusion Reverse Transcriptase
با علم به اطلاعات گفته شده در بالا، ما در شرکت دانش بنیان راتین ژن، آنزیمی را تولید کرده ایم که با افزودن دو توالی به دو سر NوC ترمینال آنزیم و همچنین Point Mutation هایی در توالی آنزیم، پایداری دمایی این آنزیم را به میزان بسیار بالایی افزایش داده ایم. همچنین با ایجاد موتاسیون در دومن RNase H، فعالیت این بخش را بدون تاثیر در سرعت و فعالیت پلیمرازی، بلاک کرده ایم. این امر موجب افزایش راندمان سنتز cDNA شده که امکان سنتز از رشته های بلند RNA تا 13000 باز را به طور کامل و یکپارچه فراهم میکند.
جهت مشاهده اطلاعات محصول کلیک کنید