بخش های توالی پرایمر PCR

• پرایمر PCR چیست
• ویژگی های پرایمر ایده آل
• بخش های مهم پرایمر
• آیا میتوان به انتهای 5′ پرایمر توالی اضافه کرد
• نتیجه گیری

پرایمر PCR

واکنش زنجیره ای پلیمراز (Polymerase Chain Reaction) واکنشی آنزیمی که توسط پلیمراز هایی مثل Taq Polymerase انجام می‌شود که در آن با استفاده از یک 3’OH آزاد و یک رشته الگو، رشته DNA مکمل ساخته شده و با انجام این واکنش به صورت زنجیره ای، قطعه هدف تکثیر پیدا میکند

در این واکنش 3’OH آزاد توسط انتهای 3′ پرایمر تامین می‌شود که این انتها نقش بسیار مهمی در شروع واکنش و تکثیر قطعه هدف ایفا میکند

ویژگی های پرایمر ایده آل

• 1.طول بین 18-24 نوکلئوتید
• 2.درصد GC بین 40-60 درصد
• 3.نزدیکی دمای ذوب جفت پرایمر ( اختلاف 1-2 درجه ایده آل)
• 4.حضور یک نوکلئوتید Cیا G در انتهای 3′ پرایمر
• 5.عدم حضور تعداد زیاد پرایمر GC در 5 نوکلئوتید انتهای 3′
• 6.عدم حضور توالی های تکراری در توالی

1.طول پرایمر ایده آل 18-24 نوکلئوتید میباشد اما افزایش یا کاهش این طول، به معنی انجام نشدن واکنش نمی‌باشد، به عنوان مثال در پرایمر های مورد استفاده در کلونینگ ژن با استفاده از Restriction Enzyme افزایش طول پرایمر تا 35 نوکلئوتید امکانپذیر بوده و واکنش انجام می‌شود

2.نوکلئوتید های Gو C به علت اتصال محکم با مکمل خود، تاثیر زیادی بر شدت اتصال پرایمر به قطعه الگو دارند به طوری که اتصال ضعیف پرایمر باعث اتصال سست آنزیم Taq به رشته هدف شده و اتصال محکم آن، تاثر منفی بر شروع واکنش میگذارد، بدین منظور تعادل در شدت اتصال اهمیت بالایی بر واکنش داشته در نتیجه درصد GC 40-60 این اتصال بهینه با فراهم میکند

3.از آنجایی که دو جفت پرایمر در یک مرحله دمایی (دمای اتصال یا annealing temperature) به قطعه هدف متصل میشوند، نزدیک بودن tm دو پرایمر به یکدیگر، در اتصال همزمان آنها نقش داشته و اختلاف بالای 2 درجه سانتی گراد موجب اختلال در اتصال کامل پرایمر ها میشود

4.نوکلئوتید انتهای 3′ پرایمر دستگیره ای برای اتصال آنزیم و شروع واکنش می‌باشد، حضور یکی از نوکلئوتیدهای GیاC در این ناحیه، اتصال محکم آنزیم در شروع واکنش را تامین میکند اما این اتصال نباید به قدری محکم باشد که مانع شروع واکنش شود

5.همانطور که در مورد 4 گفته شد، حضور تعداد بیشتر از 2 نوکلئوتید GیاC در 5 نوکلئوتید انتهای 3′ باعث اتصال بسیار محکم این ناحیه از پرایمر به ناحیه هدف شده و مانع شروع واکنش توسط آنزیم Taq میشود (آنزیم بعد از اتصال به پرایمر، در صورت مچ بودن کامل نوکلئوتید های انتهای 3’، برای شروع واکنش نیاز به جدا کردن چند نوکلئوتید انتهای 3′ از نوکلئوتید های مکمل خود داشته تا باز های جدید را به ادامه توالی پرایمر اضافه کرده و سنتز رشته الگو را شروع کند، حضور تعداد زیاد GC در این ناحیه مانع این اتفاق میشود، همچنین از دیدگاهی دیگر، تعداد بالای G C در انتهای 3’پرایمر، باعث اتصال این قسمت به نواحی غیر اختصاصی دیگر میشود ( به علت وجود توالی های تکراری GC در بخش های مختلف ژنوم) در نتیجه تکثیر اختصاصی قطعه هدف مختل شده و بخش زیادی از پرایمر ها در نواحی دیگر مصرف میشوند)

6. در ماده ژنومیک، نواحی متعددی از توالی های تکراری وجود دارد، در نتیجه حضور توالی تکراری باعث اتصال غیر اختصاصی پرایمر میشود.

بخش های مهم پرایمر

• 3 نوکلئوتید انتهای 3′
• 5نوکلئوتید انتهای 3′
• 15نوکلئوتید انتهای 3′
• نوکلئوتید های سر 5′

3نوکلئوتید انتهای 3′ نقش بسیار مهمی در اختصاصیت واکنش و شروع واکنش داشته که در صورت حضور حتی یک باز mismatch شروع واکنش مختل میشود، حضور فقط یک نوکئوتید GیاC درانتهای 3′ در شروع بهینه واکنش نقش مفیدی داشته و حضور Aیا T در این ناحیه نیز باعث افزایش اختصاصیت اتصال میشود(الزامی برای حضور نوکلئوتید خاصی در این بخش نیست اما اگه Gیا C باشه راندمان تکثیر افزایش پیدا میکنه و اگه Aیا T باشه اختصاصیت)

5 نوکلئوتید انتهای 3′ نقش زیادی بر شروع واکنش داشته و در صورت وجود تعداد بالاتر از 2 باز GیاC در این ناحیه، تاثیر منفی هر چند کمی در راندمان واکنش PCR میگذارد

اتصال کامل و صحیح 15 نوکلئوتید سمت 3′ پرایمر به ناحیه هدف، از اهمیت بالایی برخوردار بوده و حضور باز mismatch در این قسمت تاثیر منفی بالایی در تکثیر قطعه هدف میگذارد

نوکلئوتید های انتهای 5′( بعد از 15 نوکلئوتید ذکر شده در بالا) از اهمیت کمتر برخوردار بوده و میتوان 1-2 نوکلئوتید mismatch در این ناحیه قرار داد و همچنین میتوان توالی هایی به انتهای 5′ اضافه کرد، به عنوان مثال به منظور اضافه کردن جایگاه برش در قطعه تکثیر شده جهت کلونینگ ژن، میتوان 6-8 نوکلئوتید restriction site و همچنین 4-6 نوکلئوتید دیگر بعد از restriction site جهت فراهم آوردن جایگاه اتصال آنزیم برشی، به انتهای پرایمر اضافه کرد

آیا میتوان به انتهای 5′ پرایمر توالی اضافه کرد

همانطور که در بالا ذکر شد، میتوان به انتهای 5’پرایمر توالی هایی را اضافه کرد، به عنوان مثال در کلونینگ ژن به منظور تکثیر قطعه هدف که دارای نواحی برای برش توسط آنزیم محدودالاثر باشد، میتوان توالی restriction site و همچنین توالی اضافه ای (4-6 باز) برای ایجاد فضای نشستن آنزیم بر روی قطعه هدف، به انتهای 5′ توالی اضافه کرد که امکان افزایش دمای tmپرایمر تا 68 درجه سانتی گراد و طولی تا 35 باز وجود دارد

نتیجه گیری

هر بخش از توالی پرایمر نقش خاصی در واکنش PCR داره، میتوان در طراحی پرایمر، از بین توالی های معرفی شده توسط نرم افزار و سایت های طراحی پرایمر، توالی های ایده آلی را انتخاب کرد تا ستاپ واکنش PCR و Real Time PCR چالش های کمتری داشته و پروژه سریعتر انجام بشه

رعایت این شرایط به ستاپ بهتر و سریعتر واکنش کمک کرده و رعایت اصول مربوط به این نواحی اهمیت بالایی داره اما هیچ قطعیتی در واکنش های زیستی و آنزیمی وجود نداره، در مواردی پیش میاد که تمامی شرایط ایده آل یک پرایمر رو رعایت کرده اما واکنش به خوبی ستاپ و انجام نشده و مواردی هم پیش میاد که پرایمر از این منظر تناقض هایی داشته اما یک قطعه اختصاصی، شارپ و بسیار ایده آل تکثیر پیدا میکنه!!!!)