تست LAMP چیست؟ کاربرد، پرایمر ها و روش های بررسی

تست (LAMP (Loop-mediated isothermal amplification، تکثیر هم دمایی با استفاده از حلقه یا تکثیر ایزوترمال با واسطه حلقه است که جهت تکثیر DNA استفاده می‌شود.

تاریخچه

این تکنیک در سال 1998 در شرکت Eiken Chemical Company در توکیو ابداع شد تا بتواند تکثیر DNA را بر خلاف PCR که نیاز به دستگاه ترموسایکلر و سیکل های دمایی متغییر و متعدد دارد، در یک دمای ثابت و بدون نیاز به ترمال سایکلر انجام دهد.

کاربرد های LAMP

تعدادی از کاربرد های تست LAMP

• تشخیص بیماری های ژنتیکی یا عفونی خاص
• تشخیص جهش های ژنتیکی
• تشخیص ژن های مقاومت آنتی بیوتیکی
• در آزمایشگاه های صحرایی یا کنار تخت بیمار، به علت عدم نیاز به تجهیزات پیچیده از جمله ترمال سایکلر، در تشخیص های عفونی امکان استفاده دارد
• امکان استفاده از آن در بررسی RNA، با استفاده از حلقه رونویسی یا RT-LAMP که در ادامه توضیح داده می‌شود

آنزیم مورد استفاده

آنزیم تکثیر کننده DNA، آنزیم Bst DNA Polymerase است که از باکتری Bacillus stearothermophilus گرفته شده است که علاوه بر فعالیت پلیمرازی، قدرت باز کردن دو رشته DNA را حین حرکت خود داشته و بدون نیاز به افزایش دما به منظور Denaturation، فعالیت Strand Displacement را انجام می‌دهد.

پرایمر ها

در این روش معمولا از 4 پرایمر اصلی و 2 پرایمر اختیاری استفاده میشود:

• FIP (Forward Inner Primer)
• BIP (Backward Inner Primer)

دو پرایمر بالا هر کدام از دو بخش تشکیل شده اند. (FIP = F1c + F2), (BIP = B1c + B2) که شروع کننده های اصلی واکنش تکثیر LAMP هستند

• پرایمر های خارجی (Outer Primers)، شامل پرایمر های F3 و B3 هستند که این پرایمرها فقط در مراحل اولیه واکنش نقش دارند و باعث جدا شدن رشته های ساخته شده توسط FIP و BIP می‌شوند.

پرایمر های LOOP ( اختیاری )

• LF (Loop Forward)
• LB (Loop Backward)

این دو پرایمر در افزایش سرعت تکثیر و واکنش نقش داشته به طوری که زمان واکنش را از 60 دقیقه، میتوانند به 20-30 دقیقه کاهش دهند.

انواع روش های اندازه گیری میزان تکثیر

• سنجس فلوئوسنت
• کدورت سنجی
• تغییر رنگ معرف ها
• الکتروفورز
• Lateral Flow Assay (LFA)

سنجش توسط رنگ های Fluorescence

در این روش مشابه روش Real Time PCR، از رنگ های فلوئورسنت سایبرگرین(SYBR Green I)، اواگرین (EVA Green) و SYTO dyeاستفاده شده، که متناسب با میزان تکثیر DNA به صورت لحظه ای توسط دستگاه های فلورومتر، سیگنال ها ارزیابی می‌شوند

کدورت سنجی

در طی واکنش پلیمراز، از هر dNTP، یک پیروفسفات (PPi) آزاد میشود، که PPi 4 بار منفی با دو یون Mg واکنش داده و نمک نامحلول Mg₂P₂O₇( منیزیم پیروفسفات) ایجاد میشود. این ماده موجب کدورت محلول شده که با چشم یا دستگاه توربیدومتر(Turbidimeter) قابل سنجش است.

تغییر رنگ معرف ها

در محیط واکنش، میتوان معرف ها یا شناساگر های اضافه کرد که در صورت تکثیر DNA تغییر رنگ ایجاد شود، از جمله:

• Hydroxynaphthol Blue (HNB)، (هیدروکسی نفتول بلو)
• Phenol Red (حساس به تغییر pH) ،( فنول رد)
• Calcein، (کلسئین)
• Malachite Green (مالاشیت گرین)

الکتروفورز محصول LAMP

وجود قطعه DNA هدف و مثبت بودن تکثیر، در الکتروفورز آگارز به صورت الگوی نردبانی (Ladder-like pattern) دیده می‌شود که در تحقیقات و تایید نتایج انجام می‌شود.

Lateral Flow Assay (LFA) آزمون جریان جانبی

در این روش محصول LAMP بر روی نوار تست مشابه نوار تست بارداری یا رپید تست های اعتیاد و… لود شده و حین حرکت مویینگی، توسط معرف هایی مثل FITC، در صورت مثبت بودن تکثیر، باندهایی نمایان میشود.

RT-LAMP

از این روش برای تشخیص عفونت های RNA Viruses استفاده میشود که در ابتدا توسط فعالیت reverse transcriptase، ژنوم RNA به cDNA تبدیل و سپس واکنش LAMP انجام می‌شود.

Two-Step RT-LAMP

در این مدل، ابتدا در یک میکروتیوب واکنش سنتز cDNA به صورت جداگانه انجام شده و سپس نمونه cDNA به تیوب جدید برای واکنش lamp منتقل می‌شود.

One-Step RT-LAMP (رایج‌ترین روش)

در یک تیوب همزمان آنزیم ترنسکریپتاز معکوس و آنزیم Bst DNA Polymerase حضور داشته که هر کدام به ترتیب فعالیت خود را انجام می‌دهند. اما با پیشرفت تکنولوژی، آنزیم های Bst مانند Bst 2.0 یا Bst 3.0 توسعه یافت که علاوه بر واکنش DNA پلیمرازی، فعالیت Reverse Transcriptase هم دارد . در نتیجه یک آنزیم هر دو فعالیت را انجام می‌دهد.

مزایا و معایب LAMP

مزایا

• سرعت بالا ی واکنش
• عدم نیاز به تجهیزات پیشرفته
• امکان استفاده در آزمایشگاه های دارای تجهیزات کم
• حساسیت و اختصاصیت بسیار بالا در تشخیص

معایب

• طراحی پرایمر نسبت به پرایمر PCR، پیچیده تر است و نیاز به نرم افزار های تخصصی دارد.
• کمی سازی نتایج به اندازه روش Real Time PCR، دقیق نیست
• بیشتر یک تست کیفی یا نیمه کمی محسوب می‌شود
• همه ژن ها یا اهداف، برای طراحی پرایمر LAMP مناسب نیستند
• هزینه پرایمر و تهیه آنزیم، نسبت به تست PCR بیشتر است
• Carry-over Contamination: به علت تولید محصول تکثیر یافته DNA بسیار بالا، یکی از مهمترین معایب این روش، افزایش احتمال انتقال آلودگی از یک نمونه به نمونه دیگر می‌باشد.

جدول مقایسه تست LAMP و PCR

معیار مقایسه	تکنیک LAMP	تکنیک PCR
نحوه تکثیر	تکثیر در یک دمای ثابت	تکثیر با تغییرات متوالی دما
تجهیزات مورد نیاز	هیتر یا بن‌ماری کافی است	نیازمند ترمال سایکلر
آنزیم اصلی	Bst DNA Polymerase	Taq DNA Polymerase
تعداد پرایمرها	۴ تا ۶ پرایمر	معمولاً ۲ پرایمر
مدت زمان انجام	حدود ۳۰ تا ۶۰ دقیقه	حدود ۹۰ تا ۱۸۰ دقیقه
مشاهده نتیجه	رنگ‌سنجی، فلورسانس، کدورت، LFA یا ژل	ژل آگارز یا Real-Time PCR
مناسب برای محیط‌های کم‌امکانات	بسیار مناسب	محدود
پیچیدگی طراحی پرایمر	زیاد	نسبتاً کم
احتمال آلودگی محصول	بیشتر به دلیل تولید DNA فراوان	کمتر
بهترین کاربرد	تشخیص سریع و Point-of-Care	تحقیقات، تشخیص مولکولی و سنجش کمی

جمع بندی

تکنیک LAMP (Loop-mediated Isothermal Amplification) یکی از مهم‌ترین روش‌های تکثیر ایزوترمال DNA است که به دلیل انجام واکنش در دمای ثابت، سرعت بالا، حساسیت مناسب و عدم نیاز به دستگاه ترمال سایکلر، جایگاه ویژه‌ای در آزمایشگاه‌های تشخیصی و تحقیقات مولکولی پیدا کرده است. استفاده از آنزیم Bst DNA Polymerase با قابلیت Strand Displacement، طراحی اختصاصی پرایمرها و امکان ارزیابی نتایج به روش‌های مختلف مانند فلورسانس، کدورت‌سنجی، تغییر رنگ، الکتروفورز و آزمون Lateral Flow، این روش را به گزینه‌ای مناسب برای تشخیص عوامل بیماری‌زا و بررسی‌های ژنتیکی تبدیل کرده است.

علاوه بر این، توسعه روش RT-LAMP امکان شناسایی ویروس‌های دارای ژنوم RNA را نیز فراهم کرده و با معرفی آنزیم‌های نسل جدید Bst، انجام واکنش در قالب One-Step RT-LAMP ساده‌تر و سریع‌تر از گذشته شده است. به همین دلیل، LAMP امروزه به عنوان یکی از مهم‌ترین روش‌های تشخیص مولکولی سریع، به‌ویژه در محیط‌های با امکانات محدود و آزمایشگاه‌های تشخیص طبی، مورد استفاده قرار می‌گیرد.

منابع علمی مرتبط

• Loop-mediated isothermal amplification (LAMP): recent progress in research and development(https://doi.org/10.1007/s10156-013-0590-0)
• Comparative Evaluation of the LAMP Assay and PCR-Based Assays for the Rapid Detection of Alternaria solani(https://doi.org/10.3389/fmicb.2018.02089)
• Development of a Reverse Transcriptase Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP) Assay for the Sensitive Detection of Leishmania Parasites in Clinical Samples(doi: 10.4269/ajtmh.2010.09-0369)
• Loop-Mediated Isothermal Amplification (LAMP): The Better Sibling of PCR?(https://doi.org/10.3390/cells10081931)
• Loop mediated isothermal amplification (LAMP)–an alternative to polymerase chain reaction (PCR)‏