آموزش انتخاب آنزیمهای محدودالاثر برای کلونینگ ژن
یکی از کاربرد های آنزیم محدودالاثر، کلونینگ ژن در وکتور های تکثیری یا بیانی است. این آنزیم ها نواحی خاصی از DNA را شناسایی کرده وبرش میدهند.
انتخاب یک جفت آنزیم جهت کلونینگ ژن در وکتور
در فرایند کلونینگ ژن، قطعه هدف و وکتور، هر دو با یک جفت آنزیم محدودکننده مشترک برش داده و با ایجاد انتهای چسبنده، توالی Insert و وکتور جهت اتصال یه یکدیگر آماده میشوند. از آنجا که هر سمت از insert باید به صورت هدفمند در جهت مناسب در داخل وکتور قرار گیرد، باید دو سر قطعه توسط دو آنزیم متفاوت برش خورده تا از جهت مناسب به جایگاه از پیش تعیین شده خود متصل شود.
علتهای انتخاب دو آنزیم متفاوت
- اگر هدف از کلونینگ ژن، بیان پروتئین نوترکیب در میزبان باشد، جهت شروع رونویسی و ترجمه از وکتور ترنسفرم شده اهمیت بالایی دارد. در وکتور، رونویسی از جایگاه شروع رونویسی شروع شده و به سمت کدون خاتمه ادامه پیدا میکند. به منظور ترجمه و بیان پروتئین وارد شده به جایگاه کلونینگ در وکتور و جهت گیری درست بیان پروتئین از توالی Insert و ساخت پروتئین هدف با توالی مورد نظر ما، باید قطعه هدف از سمت شروع خود، به سمت نزدیک به جایگاه شروع رونویسی وکتور متصل شود و از سمت انتهای خود به سمت جایگاه خاتمه متصل شود. این جهت گیری اتصال با انتخاب دو آنزیم محدودالاثر متفاوت میسر است.
- انتخاب یک آنزیم جهت برش هر دو سمت قطعه insert و وکتور، موجب ایجاد انتهای چسبنده یکسان در هر دو طرف قطعه شده که باعث افزایش احتمال اتصال قطعات insert به صورت متوالی به یکدیگر شده که به خروج آنها از مسیر کلونینگ هدفمند میانجامد. از طرف دیگر، در وکتور با برش در یک نقطه توسط یک آنزیم، انتهای چسبنده ایجاد شده نیز به انتهای چسبنده مکمل خودش متصل شده و دوباره دو سر وکتور به یکدیگر جوش میخورند. ( بدون اضافه شدن قطعه هدف در داخل آن) در نتیجه وکتور نیز از مسیر کلونینگ هدفمند خارج شده که این موارد باعث کاهش شدید راندمان کلونینگ ژن میشود.
انتخاب یک آنزیم یا دو آنزیم در کلونینگ
| ویژگی | استفاده از یک آنزیم | استفاده از دو آنزیم |
|---|---|---|
| جهتگیری insert | تصادفی | کاملاً جهتدار |
| احتمال اتصال self-ligation در وکتور | بالا | پایین |
| احتمال اتصال چند insert پشت سر هم | زیاد | بسیار کم |
| راندمان کلونینگ | پایین | بالا |
| نیاز به انتخاب دقیق بافر | کمتر حساس | بسیار مهم |
| کنترل جهت رونویسی و بیان ژن | ندارد | دقیق و قابل کنترل |
| مراحل آمادهسازی | سادهتر | کمی پیچیدهتر |
| میزان خطا در بیان پروتئین | بیشتر | کمتر |
انتخاب دو آنزیم مناسب جهت انجام واکنش در یک مرحله
پروسه کلونینگ ژن پس از برش آنزیمی، شامل یک مرحله شستشو جهت حذف قطعات برش خورده اضافه و حذف آنزیم و سپس واکنش Ligation است. اگر نتوان دو آنزیم متفاوت جهت برش وکتور و قطعه هدف را در یک مرحله و به صورت همزمان استفاده کرد، باید برای هر کدام به صورت جداگانه مراحل شستشو و حذف آنزیم را انجام داد. از آنجایی که در هر مرحله شستشو و حذف آنزیم، بخش قابل توجهی از DNA از دست میرود تکرار آن در نهایت موجب کاهش مقادیر Insert و وکتور مناسب جهت اتصال به یکدیگر میشود.
به همین جهت باید دو آنزیمی را انتخاب کرد که در کنار یکدیگر و در یک محیط بافری مشترک فعالیت حداکثری دارند.
مسیر انتخاب دو آنزیم
- انتخاب وکتور مناسب و چک کردن لیست آنزیم های موجود در بخش restriction Site
- بررسی ژن هدف (Insert) از نظر وجود جایگاه برش آنزیمهای موجود در ناحیه Restriction Site وکتور
- بررسی بافر های مناسب برای بیشترین فعالیت آنزیم
- انتخاب یک بافر مشترک که هر دو آنزیم دارای فعالیت حداکثری هستند
بررسی وکتور
به عنوان مثال در اینجا وکتور pET-21a با هدف بیان پروتئین پروکاریوتی انتخاب شده است
همانطور که در تصویر مشاهده میکنید، در قسمت restriction site برای 9 آنزیم BamHI, EcoRI, SacI, SalI, HindIII, NotI, EagI, AvaI, xhoI جایگاه برش وجود دارد. در نتیجه تمرکز ما برای بررسی قطعه insert این 9 آنزیم خواهد بود.
بررسی آنزیم های مناسب برای برش insert
به عنوان مثال، قصد داریم آنزیم DNA adenine methylase را در پلاسمید pET 21 کلون کنیم
برای این منظور ابتدا توالی ژنتیکی این آنزیم را از سایت GenBank NCBI برمیداریم. جهت بررسی ژن و جایگاه های برش آنزیمی از سایت های آنلاین یا نرم افزار های متعددی میتوان استفاده کرد. یکی از نرم افزار های پرکاربرد بیوانفورماتیک، نرم افزار Gene Runner است که توالی ژن را در آن کپی میکنیم.
در قسمت Find Restriction Sites Within a Region ( با مارکر قرمز نشان داده شده است) لیست تمام آنزیم هایی که در داخل توالی، جایگاه برش دارند را نشان میدهد.
کاری که در این مرحله باید انجام دهیم، آنزیم هایی که در restriction site وکتور وجود داشتند را در این لیست چک کنیم و اگر در این لیست حضور داشتند از گزینه های انتخابیمان حذف کنیم. به این دلیل که قصد داریم با استفاده از دو آنزیم، دو سر قطعه هدف را برش دهیم، نه ناحیه داخلی توالی. اگر آنزیمی از رستریکشن سایت، در توالی insert، جایگاه برش داشته باشد، علاوه بر ایجاد انتهای چسبنده در دوطرف قطعه، خود قطعه را نیز از وسط برش میدهد.
در مثال بالا، جایگاه برش برای آنزیم های BamH I, Eag I در داخل توالی قطعه هدف وجود دارد، در نتیجه از گزینه های بررسی حذف میشوند.
بررسی بروشور آنزیم ها
در مرحله بعد بروشور آنزیم های باقی مانده را چک کرده تا آنزیم هایی که بافر مشترک دارند را پیدا کنیم
یکی از کمپانی های معتبر تولید کننده Restriction Enzyme، شرکت Thermo Fisher است که 5 بافر با فرمولاسیون های متفاوت برای آنزیم هایش پیشنهاد داده است. که ما در مثال این مقاله قصد داریم آنزیم و بافرهای این کمپانی را بررسی کنیم
جدول میزان فعالیت آنزیم EcoRI در بافر های Blue(B), Green(G), Orang(O), Red(R), Tango, Tango2x
جدول میزان فعالیت آنزیم XhoI
در این مثل، آنزیم EcoRI در بافر های O,R, Tango2x و بافر اختصاصی EcoRI، فعالیت 100 درصدی داشته و آنزیم XhoI در بافر های Rو Tango 2x. بافر مشترک بین این دو آنزیم، R و Tango 2X هستند.
*نکته: آنزیم EcoRI در بافر R دارای Star activity است به این معنی که، آنزیم در این بافر ممکن است در شرایطی که غلظت آنزیم و زمان انکوباسیون از حد گفته شده بیشتر شود، علاوه بر جایگاه اختصاصی خود که GAATTC است، جایگاه های غیر اختصاصی اما مشابه را نیز به اشتباه برش دهند، به عنوان مثال توالی های GAATTT یا GAATTA.
در نتیجه برای کاهش ریسک، بافر Tango 2x مناسبترین بافر مشترک بین این دو آنزیم میباشد و از آنجایی که این دو آنزیم دارای بافر مشترک با فعالیت 100% هستند، میتوانند به عنوان گزینه های انتخابی ما برای برش insert وVector باشند.
تفاوت Tango و Tango 2x
Tango و Tango 2x هر دو یک بافر هستند (Tango 10X) با این تفاوت که مقدار استفاده شده برای Tango 2x دو برابر بافر تانگو است. به عنوان مثال در واکنشی با حجم نهایی 20 میکرولیتر، برای بافر Tango 2x، مقدار 4 میکرولیتر از ویال Tango 10x برمیداریم و برای Tango، مقدار 2 میکرولیتر.
نتیجه گیری
انتخاب صحیح آنزیمهای محدودالاثر، یکی از مهمترین مراحل طراحی یک کلونینگ موفق است و تأثیر مستقیمی بر راندمان برش، اتصال (Ligation) و در نهایت موفقیت در ساخت وکتور نوترکیب دارد. انتخاب دو آنزیم متفاوت علاوه بر جلوگیری از اتصال مجدد وکتور و اتصال نامناسب قطعات Insert، موجب قرارگیری قطعه ژن در جهت صحیح داخل وکتور شده و احتمال دستیابی به کلونهای صحیح را به میزان قابل توجهی افزایش میدهد
پیش از انتخاب آنزیمها، باید جایگاههای برش موجود در وکتور و توالی ژن هدف به دقت بررسی شوند تا از عدم وجود جایگاه برش داخلی در Insert اطمینان حاصل شود. همچنین بررسی فعالیت آنزیمها در بافرهای مختلف و انتخاب یک بافر مشترک با بیشترین راندمان، امکان انجام واکنش برش به صورت همزمان (Double Digestion) را فراهم کرده و با کاهش مراحل خالصسازی، از اتلاف DNA جلوگیری میکند.
در مجموع، صرف زمان برای انتخاب آگاهانه آنزیمهای محدودالاثر، میتواند از بروز بسیاری از مشکلات رایج در کلونینگ جلوگیری کرده، هزینه و زمان آزمایش را کاهش دهد و احتمال دستیابی به کلونهای صحیح و بیان موفق پروتئین هدف را به طور قابل توجهی افزایش دهد.
سوالات متداول (FAQ)
منظور از انتهای چسبنده (Sticky End) چیست؟
انتهایی از DNA که توسط برش restriction enzyme ایجاد شده و دارای توالی تکرشتهای مکمل است و میتواند به راحتی به توالی مکمل متصل شود.
چرا انتخاب بافر مشترک اهمیت دارد؟
زیرا امکان انجام هضم همزمان دو آنزیم را فراهم کرده و از کاهش DNA در مراحل شستشو جلوگیری میکند.
Star activity چیست؟
حالتی که آنزیم محدودکننده در شرایط نامناسب، توالیهای مشابه اما غیر اختصاصی را نیز برش میدهد.
اگر یک آنزیم داخل ژن هدف سایت برش داشته باشد چه میشود؟
آنزیم قطعه DNA را در داخل ژن میبرد و باعث از بین رفتن توالی کامل insert میشود.
اگر هیچ بافر مشترکی بین دو آنزیم وجود نداشته باشد چه باید کرد؟
نبود بافر مشترک به معنی شکست نیست، انجام واکنش های برش و مراحل شستشو جداگانه، استفاده از آنزیم های اصلاح شده High-Fidelity، استفاده از بافر با فعالیت 50 % میتوانند راه حلی بر این موضوع باشند.
آیا فقط آنزیم های Thermo Fisher بافر های متعدد دارند؟
خیر، شرکت (New England Biolabs) NEB نیز با همین رویه آنزیم های محدود کننده ای را تولید کرده است .هر تولید کننده متناسب با آنزیم های خود، بافر هایی با فرمولاسیون های اختصاصی تولید و پیشنهاد میکند.
تفاوت بافر Tango و Tango 2X چیست؟
هر دو یک بافر هستند، اما Tango 2X غلظت دو برابر دارد و حجم مصرفی آن متفاوت است.
فقط با Gene Runner میشه جایگاه های برش و بافر مشترک رو پیدا کرد؟
خیر، سایت و نرم افزار های متعددی برای این هدف وجود دارد . از جمله NEBcutter (NEB), ابزار DoubleDigest Calculator، نرم افزار SnapGene و…