آیا اتوکلاو میکروتیوب را RNase Free میکند؟

در پروژه های بررسی RNA از جمله استخراج RNA، سنتز cDNA، سکانس RNA و…حفظ آن از شکست و تجزیه از اهمیت بالایی برخوردار است. یکی از مهمترین مخرب های RNA، آنزیم RNase است که در محیط، گرد و غبار، حتی بازدم تنفس وجود داشته و به راحتی به نمونه انتقال پیدا میکند. از طرف دیگر ظروف میکروتیوب، نوک سمپلر، آب و بافر ها نیز از منابع احتمالی این انزیم هستند. حذف یا غیر فعال سازی این آنزیم نکاتی دارد که در ادامه به آن میپردازیم

تحمل دمایی بالای RNase A Family

در این خانواده، ریبونوکلئاز های متعددی از جمله Ribonuclease 7، Ribonuclease 1 و … حضور داشته که دو مثال گفته شده در پوست، انواع مایعات بدن انسان به وفور یافت میشود.

بخش زیادی از ساختار ثانویه آنزیم های این خانواده از بتا شیت (β-sheet) و حدود 10-15 درصد آلفا هلیکس تشکیل شده است که به واسطه 4 پیوند دی سولفید، ساختار بسیار فشرده و مستحکمی داشته که دمای بالا را تحمل کرده و حتی در دمای اتوکلاو(121 درجه سانتی گراد) علارغم غیرفعال شدن، پس از سرد شدن دوباره بخشی از فعالیت آنزیم برخواهد گشت.

از این رو اتوکلاو کردن به طور کامل خطر، تخریب آنزیم RNase را برطرف نمیکند.

https://www.uniprot.org/uniprotkb/Q9H1E1/entry

نوکلئاز فری کردن میکروتیوب و سرسمپلر

در ابتدا توصیه می‌شود از کمپانی های معتبر وسایل RNase/DNase Free شده تهیه کنید . اما این امکان وجود دارد وسایل را در معرض DEPC قرار دهید.

نحوه ساخت محلول DEPC و Nuclease Free کردن

• ابتدا محلول غلیظ دی اتیل پایروکربنات را به نسبت 1/1000 در آب مقطر استریل 3 بار تقطیر رقیق کنید.
• سپس micro tube و pipette tip را در محلول غوطه ور کنید
• به مدت 1 روز در دمای اتاق و جای تاریک نگه دارید( توصیه میشود بر روی شیکر به آرامی هم بخورد)
• سپس محلول را صافی کرده و نوک سمپلر و میکروتیوب ها را در ظرف شیشه ای درب دار یا Rack قرار داده و اتوکلاو کنید
• پس از اتوکلاو ممکن است قطرات آب باقی مانده باشد که در این صورت در Oven دمای 80 درجه 15 دقیقه حرارت دهید تا خشک شوند.

نکته ایمنی در کار با DEPC

محلول DEPC، علارغم بوی نسبتا مطبوع، دارای گاز سمی بوده و باید زیر هود شیمیایی درب ظرف را باز کرد.