تفاوت PCR, qPCR, RT-PCR, dPCR در چیست؟
PCR (Polymerase Chain Reaction) واکنش زنجیره ای است که توسط آنزیم DNA Taq Polymerase به منظور تکثیر هدفمند و اختصاصی قطعه مورد بررسی، به تعداد قابل مشاهده یا آنالیز انجام میشود. در این واکنش، الگوی اولیه DNA، با استفاده از پرایمر اختصاصی طراحی شده بر اساس توالی هدف و نوکلئوتید های dNTP، به صورت تساعدی تکثیر پیدا میکنند. که درتحقیقات و تشخیص انواع تغییرات ژنومیک، اپی ژنتیک و… کاربرد دارد. که با توجه به هدف آزمایش و نمونه مورد بررسی، انواع مختلفی از این واکنش توسعه یافته است.
Conventional PCR یا PCR معمولی
ابتدایی ترین نوع PCR است که با استفاده از همان واکنش اولیه تکثیری، قطعه هدف تکثیر پیدا کرده و سپس جهت بررسی وجود یا عدم وجود قطعه هدف، توسط الکتروفورز در ژل آگارز، به صورت کیفی، نتیجه بررسی میشود.
کاربرد PCR معمولی
- بررسی جهش های ژنتیکی
- HLA Typing
- تشخیص کمی یک عامل عفونی
- کلونینگ ژن
- و…
مزیت PCR معمولی
- ساده و سریع
- نیاز به تجهیزات ابتدایی انجام واکنش
- هزینه پایینتر نسبت به سایر روشها
محدودیت این روش
امکان کمی سازی نتایج وجود نداشته و صرفا به صورت کیفی، حضور یا عدم حضور قطعه ژن هدف بررسی میشود.
Real Time PCR(qPCR)
در PCR معمولی، فقط نتیجه نهایی، یعنی وجود یا عدم وجود قطعه هدف قابل بررسی است اما تعداد اولیه قطعه در نمونه قابل بررسی نیست. میدانید که در واکنش PCR، در هر سیکل، در شرایط بهینه، تعداد قطعات 2 برابر شده تا در نهایت با تمام شدن سوبستراها از جمله dNTP و پرایمر، واکنش به بیشینه خود رسیده و متوقف میشود.
در PCR معمولی، چه 10 کپی از قطعه هدف در نمونه اولیه باشد چه 10000، در نهایت به بیشینه خود میرسند و ما در ژل به صورت باند آن را مشاهده میکنیم، حال آنکه این بیشینه در سیکل 33 PCR حاصل شده باشد یا در سیکل 20، تفاوتی نداشته و در PCR معمولی قابل مقایسه نیست، که این تفاوت نیاز به تست Real Time PCR را ایجاد کرد تا بتوان به صورت لحظه ای میزان تکثیر در هر سیکل را مشاهده کرد تا بتوان از روی آن در نهایت به تعداد کپی های اولیه در نمونه پی برد.
در روش ریل تایم پی سی آر، از رنگ های استفاده میشود که هر چه تعداد کپی تکثیری افزایش پیدا میکند، سیگنال افزایش پیدا کرده و صفحه نمایش به صورت نمودار نمایش داده میشود. هر چه Copy Numberقطعه اولیه بیشتر باشد، تکثیر و رسیدن به حد بیشینه سریعتر اتفاق میافتد و نمودار سریعتر بالا میآید که از روی همین تمایز میتوان به کپی نامبر اولیه پی برد.
مزیت Real Time PCR
- امکان کمی سازی نتایج
- امکان بررسی لود ویروسی موجود در نمونه
- به علت عدم نیاز به الکتروفورز، سریعتر انجام میشود
- مناسب برای تشخیص پزشکی و تحقیقات
- حساسیت بالا و امکان تشخیص تعداد کپی بسیار کم در نمونه
RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR)
این تکنیک تلفیقی از واکنش PCR اولیه و سنتز cDNA میباشد که ابتدا نمونه RNA توسط آنزیم Reverse Transcriptase به cDNA تبدیل شده سپس واکنش PCR انجام میشود.
2 روش انجام RT-PCR
- RT-PCR معمولی: استخراج RNA⭠ سنتز cDNA⭠ واکنش PCR⭠ الکترفورز
- RT-qPCR: استخراج RNA⭠ سنتز cDNA⭠ تست Real Time PCR
در تست RT-qPCR میتوان سنتز cDNA و PCR را در دو واکنش جدا از هم انجام داد، همچنین میتوان از مسترمیکس های آماده ای که علاوه بر آنزیم Taq Polymerase، آنزیم Revers Transcriptase را در کنار یکدیگر داشته که ابتدا آنزیم RT سنتز cDNA را انجام داده اماTaq غیر فعال است، سپس با بالا بردن دما به 95 درجه، RT Enzyme غیر فعال و Taq فعال میشود.
کاربرد RT-PCR
- بررسی بیان ژن
- تشخیص عفونت RNA Viruses
dPCR(Digital PCR)
این تست نوع پیشرفته تر دستگاه ریل تایم PCR است با این تفاوت که در دستگاه ریل تایم، برای هر نمونه، یک چاهک واکنش وجود دارد اما در دیجیتال PCR، برای هر آنالیز، هزاران partition میکروسکوپی وجود دارد. کاربرد این تکنیک بیشتر در تشخیص تفاوت های ژنتیکی یا جهش های ژنتیکی نادر است.
به عنوان مثال جهت تشخیص یک جهش در یک نمونه سرطانی، از نمونه اسید نوکلئیک استخراج میشود، در این نمونه ممکن است 10000هزار کپی Wild Type و 10 کپی جهش یافته وجود داشته باشد. اگر از دو پروب اختصاصی یکی برای سویه جهش یافته و یکی برای سویه وحشی استفاده کنیم، در یک چاهک واحد( در qPCR یا ریل تایم PCR) سیگنال جهش یافته ممکن است بین سیگنال سویه وحشی گم شده و توسط دستگاه شناسایی نشود و همچنین چون واکنش تکثیر در یک تیوب انجام میشود، پرایمر های فروارد و ریورس برای هر دو سویه یکسان هستند و صرفا توسط پروب متمایز میشوند، رقابتی برای پرایمر ها ایجاد شده و تمامی قطعات جهش یافته تکثیر پیدا نکنند.
به منظور جلوگیری از همپوشانی سیگنالها، دستگاه دیجیتال PCR ساخته شد. در این دستگاه ابتدا میکس واکنش PCR در بخش partitioning به چندین هزار بخش میکروسکوپی جداگانه تقسیم میشود. در بخش هایی هیچ کدام از دو قطعه وحشی و جهش یافته قرار نگرفته درنتیجه سیگنالی دریافت نمیشود. در بخش هایی فقط سیگنال مربوط به پروب اختصاصی جهش یافته و در بخش هایی سیگنال وحشی. و همچنین در چاهک هایی همزمان هر دو سیگنال در کنار یکدیگر دیتکت میشوند.
با بررسی چاهک ها و سیگنال ها، به طور دقیق و با حساسیت بسیار بالا، فراوانی قطعه وحشی و جهش یافته در یک نمونه، گزارش میشوند
مقایسه 4 روش PCR, qPCR, RT-PCR, dPCR
| نوع PCR | نمونه اولیه | قابلیت کمی سازی | کاربرد اصلی |
| Conventional PCR | DNA | – | تکثیر DNA |
| Real Time PCR(qPCR) | DNA-cDNA | + | بررسی بیان ژن |
| RT-PCR | RNA | در فرم PCR معمولی – در فرم Real Time PCR + | بررسی RNA |
| dPCR | DNA-cDNA | ++++ | سنجش جهش های نادر |
آیا دیجیتال PCR جایگزین qPCR میشود؟
به علت مزیت و معایب هر دو روش و اینکه هر کدام برای اهداف خاصی طراحی شده اند، هر دو کماکان در آزمایشگاه های ژنتیک کاربردهای خود را دارند.
آیا اساس این 4 روش یکی است؟
بله. در هر 4 روش، اساس واکنش PCR که Denaturation – Annealing – Extension بوده و به صورت تناوبی تکرار میشود، اتفاق میافتد.
تفاوت qPCR و RT-PCRچیست؟
هدف تست RT-PCR آنالیز RNA است اما در qPCR هدف بررسی DNA/cDNA به صورت کمی میباشد که میتوان این دو روش را با یکدیگر ادغام کرد که به آن RT-qPCR گفته میشود و در پروژه های بررسی بیان ژن این عنوان مناسبتر میباشد.
حساسترین تست برای بررسی جهش های نادر کدام است؟
علارغم اینکه امکان بررسی SNP ها در ریل تایم PCR و با استفاده از مستر میکس های HRM وجود دارد، تست digital PCR از حساسیت و دقت بسیار بالاتری برخوردار است.
تفاوت اندازی گیری نسبی و مطلق در PCR چیست؟
در تست qPCR به صورت نسبی و با مقایسه دو نمونه با یکدیگر یا مقایسه با نمونه های استاندارد، به صورت تقریبی نتایج بدست میآید اما در تست dPCR به صورت دقیق و کمی، تعداد واقعی قطعات محاسبه میشود.
تفاوت PCR معمولی با Real Time PCR چیست؟
در PCR معمولی از دستگاه ترموسایکلر و سیستم الکتروفورز استفاده میشود، اما در ریل تایم PCR، نیازی سیستم الکتروفورز نداشته و دستگاه به صورت لحظه ای، حین تکثیر، آنالیز را هم انجام میدهد.
دقیق ترین روش PCR کدام است؟
Digital PCR با حساسیت بسیار بالا و قابلیت اندازه گیری کمی مطلق