8 نوع وکتور کلونینگ (Cloning Vector)

در بیولوژی مولکولی، به منظور اهدافی از جمله تکثیر قطعه ژنتیکی خاص، نگهداری آن، تولید پروتئین نوترکیب(Recombinant Proteins) و… نیاز به انتقال آن قطعه به یک حامل ژنتیکی است تا به واسطه آن، قطعه ژنتیکی(insert) را وارد یک سلول کرد. این حامل، vector نام داشته و با دارا بودن نواحی خاص، وظایف دریافت، تکثیر، رونویسی و… قطعه هدف را انجام می‌دهد.

فهرست مطالب

• ملزومات وکتور
• اجزای کلیدی vector
• مبدا همانندسازی (Origin of Replication)
• کپی نامبر وکتور در میزبان
• سازگاری وکتورها(compatibility)
• ژن‌های انتخابی یا غربالگری (Selectable Marker)
• جایگاه چندگانه برش (Multiple Cloning Site (MCS) )
• پلاسمید / Plasmid
• Lambda Bacteriophage / باکتریوفاژ λ
• Cosmid / کاسمید
• PAC (P1 Artificial Chromosome)
• تفاوت PAC و کاسمید
• Bacterial artificial chromosomes (BACs)
• Yeast artificial chromosomes (YACs)
• (Human artificial chromosomes (HACs
• Shuttle Vector
• جمع بندی
• سوالات متداول

ملزومات وکتور

• توانایی تکثیر مستقل در سلول میزبان
• دارا بودن یک ناحیه Multiple Cloning Site جهت ورود insert
• ورود insert مانع همانندسازی وکتور نشود
• داشتن ژن یا ژن هایی جهت غربالگری( مثل ژن مقاومت آنتی بیوتیک)
• امکان استخراج راحت از سلول میزبان

اجزای کلیدی vector

مبدا همانندسازی (Origin of Replication)

مبدا همانند سازی جهت تکثیر وکتور در سلول میزان وجود دارد که در پروکاریوت و یوکاریوت تفاوت هایی با یکدیگر دارند. انتخاب وکتور بر اساس مبدا همانندسازی، به دو عامل میزان Copy Number مورد نیاز از هر وکتور در میزبان و سازگار بودن (Compatible) دو وکتور متفاوت در یک میزبان (به صورت همزمان)، بستگی دارد.

کپی نامبر وکتور در میزبان

تعداد کپی از هر وکتور در میزبان، به مبدا همانندسازی و تنظیم این چرخه بستگی دارد. پلاسمید ها از این نظر به دو گروه  relaxed plasmids و Stringent plasmids تقسیم بندی می‌شوند. در گروه relaxed همانندسازی بدون توجه به تکثیر سلول، به صورت خودمختار و آزاد صورت گرفته و ممکن است 20-500 کپی از آن در یک سلول وجود داشته باشد. در گروه Stringent تکثیر به میزان زیادی به منابع در دسترس سلول و مرحله تکثیر آن بستگی داشته و کنترل شده است و سیستم partitioning جهت تقسیم بندی پلاسمید بین دو سلول دخترحین تکثیر، به صورت دقیق اجرا می‌شود.

سازگاری وکتورها(compatibility)

در پروژه هایی، ممکن است نیاز به حضور دو وکتور متفاوت به صورت همزمان در یک میزبان باشد، در این صورت دو وکتور متفاوت، باید با یکدیگر سازگاری داشته باشند.

در مثال زیر تعدادی از وکتور ها و گروه بندی ناسازگازی آنها آورده شده است. چنانچه قصد دارید از دو وکتور متفاوت به صورت همزمان استفاده کنید، باید وکتور‌هایی را انتخاب کنید که گروه بندی ناسازگاری متفاوتی داشته باشند. وکتور‌هایی که گروه بندی مشترکی دارند، به علت رقابت بر سر مکانیسم همانندسازی مشترک، تکثیر ناپایداری را برای یکدیگر ایجاد می‎‌کنند.

ژن‌های انتخابی یا غربالگری (Selectable Marker)

در فرایند کلون سازی ژن، تمامی سلول های میزبان، وکتور را دریافت نمی‌کنند و همچنین همه سلول های دریافت کننده وکتور، وکتور نوترکیب هدف ما را دریافت نکرده ووکتور آنها، غیر نوترکیب است. به منظور تمایز و جداسازی سلول های نوترکیب دریافت کننده وکتور نوترکیب، که سلول هدف ما هستند، از سایر سلول ها، در وکتور ژن هایی وجود دارند . از جمله ژن مقاومت آنتی بیوتیکی( جهت تمایز سلول های دریافت کننده وکتور از سلول فاقد آن) و سیستم β-گالاکتوزیداز( جهت تمایز وکتور های نوترکیب حاوی قطعه insert و وکتور های فاقد آن)

جایگاه چندگانه برش (Multiple Cloning Site (MCS) )

در این ناحیه، تعدادی restriction enzyme جهت اتصال آنزیم های محدودالاثر، وجود داشته که جهت برش وکتور از این ناحیه و ورود قطعه insert به آن طراحی شده است. در سیستم غربالگری β-Galactosidase، این ناحیه MCS در میان ژن آنزیم بتا گالاکتوزیداز قرار گرفته و با ورود insert به آن، بیان ژن بتا گالاکتوزیداز مختل شده و در نهایت موجب دیده شدن کلونی های سفید در محیط کشت می‌شود و وکتور‌های غیرنوترکیب(وکتور هایی که insert را دریافت نکرده اند)، با بیان بتاگالاکتوزیداز، موجب تغییر رنگ معرف اضافه شده به محیط (x-gal) به آبی شده و کلونی های آبی رنگ دیده می‌شود.( کلونی های آبی/ سفید)

انواع وکتور کلون سازی

• Plasmids / پلاسمید
• Bacteriophage / باکتریوفاژ
• Cosmids / کاسمید
• PAC (P1 Artificial Chromosome)
• Bacterial artificial chromosomes (BACs)
• Yeast artificial chromosomes (YACs)
• (Human artificial chromosomes (HACs
• Shuttle Vector

پلاسمید / Plasmid

پلاسمید، دئوکسی ریبونوکئیک اسیدی دو رشته ای حلقوی است که خارج از DNA کروموزمی باکتری قرار گرفته و طولی بین 500 تا 400.000 جفت باز دارد و می‌تواند قطعاتی تا حداکثر 10کیلو باز را در خود جای دهد و طی فرایند ترنسفرماسیون (Transformation) وارد سلول میزبان شود. از راه های متداول ترنسفرماسیون نیز انتقال توسط کلسیم کلراید و شوک حرارتی و الکتروپوریشن (Electroporation) می‌باشد.

Lambda Bacteriophage / باکتریوفاژ λ

باکتریوفاژ، ویروس آلوده کننده باکتری است که به صورت انگلی، در داخل باکتری تکثیر پیدا کرده که میتواند بخش یا تمام آنزیم های موجود در باکتری را در این امر، برای خود به کار گیرد. این وکتور امکان انتقال ژنوم خود و قطعه insert را طی مکانیسمی، به داخل ژنوم میزبان که باکتری است را دارد اما توالی ژنوم باکتریوفاژ برای کلونینگ ضروری نبوده و می‌توان تمام ژنوم باکتریوفاژ را با قطعه insert بلند جایگزین کرد. ظرفیت این وکتور طولی تا 20kb برای insert می‌باشد.

Cosmid / کاسمید

کاسمید، یک وکتور مهندسی شده است که از تلفیق پلاسمید و توالی COS باکتریوفاژ لامبدا ساخته شده است. تلفیق پلاسمید و cos موجب امکان انتقال قطعات بلندتر(تا 45kb) نسبت به پلاسمید می‌شود.

پلاسمید امکان انتقال قطعات حداکثر تا 10kb را دارد. با افزایش سایز قطعه insert، احتمال و راندمان انتقال به سلول میزبان کاهش پیدا می‌کند. به منظور برطرف کردن کاهش راندمان انتقال، توالی cos به عنوان سیگنالی عمل کرده که موجب قرار گرفتن کاسمید در داخل ساختار فاژی شده و انتقال به میزبان مشابه فاژ صورت می‌گیرد و راندمان انتقال نسبت به روش ترنسفرماسیون پلاسمید، افزایش پیدا می‌کند. مراحل انجام شده به صورت زیر می‌باشد:

1. insert وارد کاسمید شده
2. کاسمید نوترکیب، در محیط آزمایشگاه، در کنار عصاره فاژی (λ Packaging Extract)قرار می‌گیرد( عصاره باکتریوفاژ، حاوی کپسید، دم و اجزای بسته بندی اما بدون ژنوم فاژ هستند.)
3. اجزای بسته بندی، ناحیه cos روی کاسمید را به عنوان یک سیگنال شناسایی کرده و با قرار دادن کپسید و دم به اطراف وکتور، یک شبه فاژ ایجاد می‌کنند
4. فاژ سنتتیک وارد باکتری میزبان می‌شود
5. تکثیر در داخل باکتری میزبان اتفاق می‌افتد. ( از آنجایی که ژن های باکتریوفاژ در کاسمید وجود ندارند، هیچ تکثیر فاژی صورت نگرفته و تکثیر کاسمید، مشابه تکثیر پلاسمید در باکتری اتفاق می‌افتد)

PAC (P1 Artificial Chromosome)

کروموزوم مصنوعی P1 وکتوری مشابه کاسمید است که از باکتریوفاژ P1 و پلاسمید مشتق شده است و ظرفیت کلونینگ قطعات 100-300kb را دارد.

تفاوت PAC و کاسمید

Bacterial artificial chromosomes (BACs)

وکتور BAC بر خلاف اسمش که دارای کلمه کروموزوم می‌باشد، یک پلاسمید حلقوی بلند است که از پلاسمید F باکتری E.coli مشتق شده است. این وکتور دارای ژن های oriS، repE و par از پلاسمید F است که oriS در همانند سازی مستقل وکتور نقش داشته، repE پروتئین آغازکننده همانندسازی را کد می‌کند که موجب کنترل تعداد کپی های موجود در سلول( 1-2 عدد) می‌شود و ژن های parAو parB مسئول توزیع یکنواخت کپی های این وکتور بین دو سلول دختر حین تقسیم هستند.

از آنجایی که ژن repE موجب کنترل تعداد وکتور در سلول، بین 1 یا 2 عدد می‌شود و مشابه تعداد هر کروموزوم در سلول بوده و توان حمل ژن های متعدد و بلند را دارد به این اسم نامگذاری شده است.

این وکتور امکان حمل و انتقال توالی به طول 100-300kb را داشته که در پروژه های ژنوم مثل پروژه ژنوم انسان استفاده شده است.

Yeast artificial chromosomes (YACs)

این وکتور از اجزای طبیعی کروموزوم مشتق شده از مخمر ساکارومایسس سرویزیه (Saccharomyces cerevisiae) است که مشابه یک کروموزوم، خطی بوده، دارای یک سانترومر و دو تلومر، ژن های غربالگری و ناحیه MCSاست و ظرفیت دریافت و انتقال 200kbتا 1 مگاباز را دارد.

(Human artificial chromosomes (HACs

این وکتور یک میکرو-کروموزوم انسانی است که جهت انتقال قطعات بسیار بلند 6-10 مگاباز به سلول های انسانی خصوصا سلول های mammalian کاربرد دارد. این وکتور می‌تواند مشابه یک کروموزوم در داخل سلول حضور داشته و در بررسی فعالیت های کروموزومی و بیان پروتئین مورد استفاده قرار گیرد.

Shuttle Vector

این وکتور با دارا بودن مبدا همانندسازی مناسب برای دو یا چندین میزبان متفاوت، به عنوان پل ارتباطی بین دو میزبان مختلف عمل کرده و در هر دو میزبان تکثیر شده و با دارا بودن دو پروموتر مناسب برای هر میزبان، امکان بیان پروتئین را دارد.

ویژگی های شاتل وکتور

• قابلیت همانندسازی در دو یا چند میزبان
• امکان انتقال آسان ژن بین سیستم‌های مختلف
• مناسب برای کلونینگ و بیان ژن
• کاهش نیاز به کلونینگ مجدد هنگام تغییر میزبان
  

به عنوان مثال YEp24 یک پلاسمید شاتل است که امکان جابجایی بین باکتری Escherichia coli و مخمر Saccharomyces cerevisiae را دارد.

جمع بندی

در این مقاله با انواع وکتورهای کلونینگ و نقش آن‌ها در مهندسی ژنتیک و بیولوژی مولکولی آشنا شدیم. هر وکتور با توجه به ویژگی‌هایی مانند ظرفیت حمل DNA، نوع میزبان، تعداد کپی، پایداری و کاربرد، برای هدف مشخصی طراحی شده است.

پلاسمیدها برای کلونینگ قطعات کوچک و آزمایش‌های معمول مناسب هستند، در حالی که باکتریوفاژ λ و کاسمیدها امکان انتقال قطعات بزرگ‌تر DNA را فراهم می‌کنند. برای کلونینگ قطعات بسیار بزرگ، از PAC، BAC و YAC استفاده می‌شود که هر کدام مزایا و محدودیت‌های خاص خود را دارند. در نهایت، HACها برای انتقال قطعات بسیار بزرگ DNA به سلول‌های پستانداران و شاتل وکتورها برای انتقال ژن بین دو میزبان مختلف طراحی شده‌اند.

انتخاب وکتور مناسب به عواملی مانند اندازه قطعه DNA، نوع سلول میزبان، هدف آزمایش، میزان بیان ژن، تعداد کپی مورد نیاز و پایداری وکتور بستگی دارد. آشنایی با اجزای اصلی وکتورها مانند Origin of Replication، ژن‌های انتخابی و ناحیه Multiple Cloning Site نیز در طراحی صحیح آزمایش‌های کلونینگ اهمیت زیادی دارد.