• ratingene.fardin
• دسته‌بندی نشده

بررسی بیان ژن به روش Real-Time PCR: راهنمای جامع

مقدمه:

از آنجایی که در انواع فرایند های داخل سلولی، بیان ژن ها تحت تغییراتی زیاده شده و این تغییرات ممکن است منجر به اختلالات و بیماری شود، در دنیای بیولوژی مولکولی، تحقیقات و حتی تشخیص و درمان، بررسی بیان ژن از اهمیت بالایی برخوردار که یکی از روش‌های دقیق و پرکاربرد در این زمینه، تکنیک Real-Time PCR یا qPCR است که امکان اندازه‌گیری دقیق و کمّی بیان ژن را فراهم می‌کند. در این مقاله، به بررسی اصول، مراحل، مزایا، نکات کلیدی و چالش‌های این روش می‌پردازیم.

Real-Time PCR چیست؟

Real-Time PCR یک تکنیک پیشرفته بر پایه PCR (واکنش زنجیره‌ای پلیمراز) است که امکان مشاهده و تحلیل در لحظه اطلاعات را فراهم می آورد، در این روش، مقدار DNA در هر سیکل دو برابر شده تا به مقدار کافی جهت شناسایی توسط سنسور های دستگاه ریل تایم پی سی آر برسد و از آنجایی که هر چه مقدار DNA اولیه بیشتر باشد، رسیدن به مقدار کافی جهت شناسایی سنسور ها زودتر اتفاق افتاده و نمودار نمایش داده شده زودتر به حداکثر میرسد و به همین صورت هر چه مقدار DNA الگوی اولیه کمتر باشد، این اتفاد دیرتر صورت میگیرد. این فناوری به دلیل دقت بالا، سرعت مناسب و قابلیت کمی‌سازی، در تحقیقات ژنتیکی، پزشکی، داروسازی و حتی صنایع غذایی کاربرد دارد.

اصول کار Real-Time PCR

این روش بر پایه تکثیر اختصاصی یک توالی DNA هدف با استفاده از آنزیم taq polymerase، پرایمر های اختصاصی و نوکلئوتید میباشد و با استفاده از رنگ‌های فلورسنتی مانند SYBR Green یا پروب‌های اختصاصی مانند TaqMan، میزان تکثیر DNA در هر چرخه به صورت سیگنال های ارسال به دستگاه و نمایش آن به صورت گراف و یا نمودار قابل مشاهده است. Real-Time PCR از دو روش عمده برای بررسی میزان بیان ژن استفاده می‌کند:

1. روش نسبی (Comparative Ct یا ∆∆Ct):

در این روش، بیان ژن هدف نسبت به یک ژن مرجع در نمونه های مختلف به صورت نسبی مقایسه می شود

1. روش مطلق (Absolute Quantification):

در این روش، مقدار دقیق DNA هدف با استفاده از استاندارد هایی با کپی نامبر از پیش تعیین شده، قابل اندازه گیری است

مراحل انجام Real-Time PCR

1. استخراج RNA و سنتز cDNA:

   • استخراج RNA با کیفیت بالا از انواع نمونه های بیولوژیک.(جهت مشاهده مطالب استخراج RNA میتوانید کلیک کنید)

   • بررسی خلوص و کمیت RNA با استفاده از دستگاه‌های نانودراپ و الکتروفورز ژل آگارز.

   • سنتز cDNA با استفاده از آنزیم رونوشت معکوس (Reverse Transcriptase) و تهیه نمونه آماده برای qPCR.

2. طراحی پرایمرها و پروب‌ها:

   • جهت طراحی پرایمر میتوان از نرم افزار و سایت های متعددی استفاده کرد و این پرایمر دارای پارامتر های متعددی است که در یک صفحه اختصاصی به طور کامل توضیح داده خواهد شد

   • طراحی پروب‌های فلورسنتی مانند TaqMan با دقت کافی و  نویز پس‌زمینه پایین

   • در مرحله نهایی باید توالی پرایمر ها از لحاظ ساختار های ثانویه، درصدGC، تکثیر قطعات هدف و یا غیر اختصاصی و… مورد بررسی قرار گیرد.

3. تنظیم واکنش PCR:

   • ترکیب مستر میکس ریل تایم و پرایمرها، نمونه و…(این مرحله متناسب با اطلاعات موجود در بروشور مستر میکس انجام می شود که به طور نمونه مستر میکس سایبر گرین شرکت امپلیکون در اینجا آورده شده است

نکته قابل ملاحضه:
 در صورت استفاده از دستگاه های ریل تایم دارای پلیت خوانشی از جمله ABI، Roche و… که نمونه ها در داخل جایگاه ثابت مشابه پلیت الایزا قرار میگیرند، به منظور برطرف کردن اختلاف شدت نور فلوئورسنت، به دلیل اختلاف فاصله هر چاهک از دتکتور، از رنگ ROX استفاده می شود، در نتیجه باید از مستر میکس حاوی رنگ ROX استفاده کنیم، اما در صورت استفاده از دستگاه های دارای روتور که نمونه ها داخل رک های گردان قرار گرفته و هر نمونه به نوبت به صورت چرخشی جلوی دتکتور قرار گرفته و دیگر اختلاف فاصله ای بین دتکتور و نمونه ها در جایگاه های مختلف وجود ندارد، نیاز به رنگ ROX نبوده و از مستر میکس های فاقد راکس میتوانید استفاده کنیم.

در این تصویر اختلاف شدت نور فلوئورسنت در جایگاه با فاصله های متفاوت از دتکتور را مشاده میفرمایید

در این تصویر، مکانیسم چرخشی رک نمونه از مقابل دتکتور را مشاهده میفرمایید

      2.مقادیر مورد نیاز از اجزای واکنش را در میکروتیوب های اختصاصی هر دستگاه ریخته و با هم مخلوط میکنیم

      3. متناسب با پروفایل دمایی مناسب واکنش PCR که برگرفته از بروشور مستر میکس و دمای Tm پرایمر ها میباشد، برنامه دمایی دستگاه را تنظیم و ران میکنیم

مثالی از پروفایل دمایی

1. اجرای Real-Time PCR و تحلیل داده‌ها:

   • تنظیم چرخه‌های دمایی شامل دناتوراسیون، اتصال رایمر و گسترش.

   • تحلیل منحنی‌هایکثیر و منحنی ذوب برای ارزیابی اختصاصیت واکنش.

   • مقایسه مقادیر Ct (Cycle threshold) برای بررسی بیان ژن.

مزایای Real-Time PCR

• دقت و حساسیت بالا: امکان تشخیص مقادیر کم بیان ژن و بررسی تفاوت‌های جزئی در نمونه‌ها.

• کمی‌سازی دقیق: تعیین مقدار دقیق تعداد نمونه اولیه، با استفاده از استانداردهای حاوی copy number مشخص

• سرعت بالا: امکان انجام واکنش در زمان کوتاه و دریافت داده‌ها به‌صورت لحظه‌ای.

چالش‌ها و محدودیت‌های Real-Time PCR

• آلودگی نمونه‌ها: در صورت وجود آلودگی های نمکی و مهارکننده آنزیم taq، انجام واکنش مختل می شود

• بهینه‌سازی دشوار: نیاز به بهینه‌سازی دقیق غلظت پرایمرها، پروب‌ها و پروفایل دمایی می باشد

• خطای تحلیل داده‌ها: نیاز به تفسیر دقیق منحنی‌های Ct و انتخاب مناسب ژن‌های مرجع برای کاهش خطا.

نکات کلیدی برای بهینه‌سازی Real-Time PCR

• کیفیت RNA: استفاده از RNA خالص و بدون آلودگی برای دقت بالاتر.

• طراحی مناسب پرایمرها و پروب‌ها: عدم وجود دایمر و ساختار های ثانویه بین پرایمر ها و عدم تکثیر قطعات غیر اختصاصی 

• انتخاب رنگ فلورسنت مناسب: انتخاب بین SYBR Green و پروب‌های TaqMan با توجه به هدف مطالعه.

• بهینه‌سازی شرایط PCR: تنظیم صحیح دما و غلظت مواد واکنش برای افزایش کارایی و کاهش خطا.

• استفاده از کنترل‌های داخلی: کنترل‌های مثبت و منفی برای اعتبارسنجی داده‌های آزمایش.

نتیجه‌گیری

Real-Time PCR یک روش پیشرفته و قابل‌اعتماد(gold standard) برای بررسی بیان ژن است که در بسیاری از پژوهش‌های بیولوژی مولکولی و زیست‌پزشکی مورد استفاده قرار می‌گیرد. با رعایت نکات کلیدی و استفاده از مواد و کیت‌های با کیفیت، می‌توان داده‌های دقیق و قابل اعتمادی از این روش به‌دست آورد.

برای خرید محصولات مرتبط با Real-Time PCR، تهیه مواد مصرفی با کیفیت بالا و دریافت مشاوره تخصصی، با تیم ما در شرکت دانش بنیان راتین ژن تماس حاصل فرمایید. ما آماده ارائه راهکارهای تخصصی برای بهبود تحقیقات و آزمایش‌های شما هستیم.

ratingene.fardin وب‌سایت