Gradient PCR چیست و چگونه انجام می‌شود؟

به بررسی چندین دما برای یکی از مراحل annealing یا extension واکنش PCR در یک ران، Gradient PCR گفته می‌شود.

اگر در تنظیم دمای اتصال پرایمر (annealing)، دمای (Tm) نوشته شده بر روی میکروتیوب پرایمر یا دمای اندازه گیری شده توسط سایت یا نرم افزارهای بیوانفورماتیک را وارد کردید اما علارغم اطمینان از DNA یا cDNA و مستر میکس، واکنش PCR به خوبی انجام نشد یا باند قابل انتظاری مشاهده نکردید، ممکن است به علت دمای نادرست مرحله annealing باشد. در پی سی آر گرادیانت، به طور همزمان و در یک Run، چندین دما برای این مرحله امتحان شده و در نهایت می‌توانید بهترین دما را انتخاب کرد.

دمای اتصال پرایمر (annealing Tm)

هر رشته پرایمر بر اساس شرایط بافری، نمک و یون های موجود و… میتواند دمای اتصال متفاوتی داشته باشد.

در مثال زیر، tm یک پرایمر توسط سایت OligoAnalyzer در شرایط کاملا یکسان، اما تغییر جزئی در غلظت یون منیزیم و تاثیر آن بر melting temperature نشان داده شده است.

در این مثال به طور واضح نشان داده شده است که کوچکترین تغییر در غلظت نمک های موجود در بافر مسترمیکس، دمای اتصال نیز تغییر می‌کند.

یا در مثال زیر، tm همان پرایمر که در الیگوآنالایزر، 57.3 گزارش شده است در سایت primer blast NCBI، دمای 52.14 تخمین زده شده است

در دو مثال بالا، متوجه می‌شویم که تغییر در شرایط بافری، Tm پرایمر تغییر کرده و همچنین به واسطه الگوریتم متفاوت سایت های مختلف، Tm تخمین زده شده توسط آنها متفاوت می‌شود. در نتیجه انتخاب یک دمای دقیق برای Tm پرایمر و مرحله annealing، پیش از آزمایش، آسان نبوده و نیاز به انجام تست هایی است.

انتخاب دمای annealing

همان‌طور که اشاره شد، دمای ذوب (Tm) یک پرایمر ممکن است دقیقاً با مقداری که توسط نرم‌افزارها پیش‌بینی می‌شود مطابقت نداشته باشد. همچنین، پرایمری که در پروژه‌های قبلی عملکرد مطلوبی داشته است، لزوماً در یک پروژه جدید همان کارایی را نشان نمی‌دهد. از آنجا که معمولاً به نوع و ترکیب مسترمیکس استفاده‌شده در پروژه‌های پیشین توجه کافی نمی‌شود، انتقال مستقیم شرایط واکنش، به‌ویژه پروفایل دمایی، می‌تواند با چالش همراه باشد و نیاز به بهینه‌سازی مجدد شرایط PCR را ایجاد کند.

به‌منظور رفع چالش مربوط به تعیین دمای اتصال (Annealing)، توصیه می‌شود ابتدا از یک نمونه DNA یا cDNA با کیفیت و قابل اعتماد استفاده شود. سپس، در شرایطی که تمامی اجزای واکنش، از جمله غلظت مواد و ترکیب مسترمیکس، کاملاً ثابت نگه داشته شده‌اند، آزمون PCR گرادیانت انجام گیرد. در این آزمایش، تنها متغیر مورد بررسی، دمای مرحله اتصال (Annealing) است تا دمای بهینه اتصال پرایمر با حداقل تأثیر سایر عوامل تعیین شود.

نحوه انجام تست PCR گرادیانت

• 1. ابتدا با توجه به دستگاه ترموسایکر در دسترس، تعداد ردیف یا ستون های قابل تنظیم دمای گرادیانت را پیدا کنید.( پیدا کردن تعداد دمای قابل تنظیم تست گرادیانت، از طریق بررسی کاتالوگ یا نرم افزار دستگاه و همچنین تعداد بلوک های جدا از هم در صفحه پلیت دستگاه، امکان پذیر است.

2. آماده سازی مواد واکنش PCR

متناسب با تعداد نمونه یا دمایی که قصد بررسی داریم، مسترمیکس( در صورت استفاده از آنزیم Taq جداگانه، از آنزیم، بافراختصاصی، MgCl2، dNTP و… استفاده می‌شود، اما در مسترمیکس، تمامی این مواد در کنار یکدیگر به صورت آماده وجود دارند)، پرایمر، DNA و آب با یکدیگر مخلوط می‌شوند.

مواد واکنش PCR

به عنوان مثال قصد داریم از مستر میکس سایبرگرین برند امپلیکون( 2X Ampliqon SYBR green Master Mix ) در پروژه بررسی بیان ژن استفاده کنیم

ماده	حجم (میکرولیتر)
2X مسترمیکس	12.5
پرایمر فروارد(10μM)	0.5
پرایمر ریورس(10μM)	0.5
cDNA	2
آب	9.5

در این مثال، حجم های گفته شده برای یک واکنش آورده شده اند. برای بررسی 6 دمای مختلف، باید به اندازه 6 واکنش، این مواد را با یکدیگر مخلوط کرد و اگر نیاز به تکرار(duplicate) برای هر دما وجود دارد، مواد را به اندازه 12 واکنش با یکدیگر مخلوط میکنیم.

در مثال بالا، قصد داریم 6 دما را به صورت Single test بررسی کنیم

مواد	حجم ( microLiter)
2x masterMix	75
forward primer	3
reverse primer	3
cDNA	12
DW	57

تمام این مواد را در یک میکروتیوب با یکدیگر مخلوط کرده سپس در 6 میکروتیوب جداگانه تقسیم میکنید

*نکته: همانطور که گفته شد، در اینجا آزمایش، تنها متغیر ما، دما است.باید تمامی اجزا به طور یکسان در میکروتیوب ها تقسیم شوند، در نتیجه توصیه میشود تمام مواد را به صورت بالک در یک میکروتیوب با یکدیگر مخلوط و سپس الیکوت کنید.

تنظیم پروفایل دمایی

هر دستگاه از هر برند، محیط کاربری نرم افزار اختصاصی خود را داشته که در اینجا مثالی از دستگاه Applied Biosystems Veriti™ Thermal Cycler نمایش داده شده است.

پس از تنظیم پروفایل دمایی، برای Annealing step گزینه Veriflex را انتخاب می‌کنیم و در صفحه ایجاد شده، دماهایی که قصد بررسی را داریم وارد می‌کنیم.

انتخاب دمای گرادیانت

به طور معمول، نسبت به دمای نوشته شده بر روی میکروتیوب پرایمر، 2-5 درجه پایینتر و 2-5 درجه بالاتر تنظیم می‌شود و دستگاه با توجه به تعداد بلوک ها، این بازه دمایی را بین چاهک ها تقسیم می‌کند.

بررسی نتایج

در مرحله آخر، میکروتیوب های شماره گذاری شده که هر شماره مربوط به یک بلوک یا دما است را در ژل آگارز، الکتروفورز کرده و چاهک یا چاهک هایی که باند مورد نظر به صورت شارپ و بدون وجود باند های غیر اختصاصی دیده شدند، آن دما به عنوان دمای اصلی انتخاب می‌شود.

جمع‌بندی

Gradient PCR یکی از کاربردی‌ترین روش‌ها برای بهینه‌سازی واکنش PCR است که امکان بررسی هم‌زمان چندین دمای Annealing یا در برخی کاربردها دمای Extension را در یک ران فراهم می‌کند. از آنجا که دمای اتصال پرایمر تحت تأثیر عواملی مانند ترکیب بافر، غلظت یون منیزیم، نوع مسترمیکس و… قرار دارد و روش محاسبه Tm و حتی الگوریتم نرم‌افزارهای طراحی پرایمر با یکدیگر تفاوت دارند، همیشه نمی‌توان تنها بر اساس دمای محاسبه‌شده توسط نرم‌افزار و سایت ها یا عدد روی میکروتیوب، بهترین دمای Annealing را انتخاب کرد.

در تست Gradient PCR تنها یک متغیر، یعنی دمای مرحله Annealing، تغییر می‌کند و سایر اجزای واکنش ثابت باقی می‌مانند. این موضوع باعث می‌شود بتوان مناسب‌ترین دما را بر اساس شدت باند، اختصاصیت یا عدم تشکیل محصولات غیراختصاصی انتخاب کرد. انجام این مرحله در ابتدای هر پروژه جدید، به‌ویژه هنگام استفاده از پرایمر یا مسترمیکس جدید، می‌تواند از صرف زمان و هزینه برای تکرار آزمایش‌ها جلوگیری کرده و کیفیت نتایج PCR را به‌طور قابل‌توجهی افزایش دهد.

سوالات متداول (FAQ)

مقالات علمی مرتبط

• (Optimization of the annealing temperature for DNA amplification in vitro(DOI: 10.1093/nar/18.21.6409
• Optimization and troubleshooting in PCR( DOI: 10.1101/pdb.ip66)
• Protocol for the Use of PCR-Denaturing Gradient Gel Electrophoresis and Quantitative PCR to Determine Vaginal Microflora Constitution and Pathogens in Bacterial Vaginosis