Poly A Polymerase
مقدمه
Poly (A) Polymerase آنزیمی است که در فرآیند افزودن دم پلی‌آ (Polyadenylation)، AMP را از سوبسترای ATP به سر 3` RNA اضافه می‌کند و این واکنش برای پایداری، ترجمه و تنظیم میکرو RNAها اهمیت بالایی دارد. شرکت راتین ژن مفتخر است که برای اولین بار در ایران این کیت را با فعالیت و پایداری بسیار بالا تولید کرده است و در این بلاگ، نحوه استفاده، بررسی بیان microRNA، روش‌های غیرفعال‌سازی آنزیم، حل مشکلات احتمالی (Troubleshooting) و نکات مهم مربوط به این کیت را بررسی خواهیم کرد.
کاربردهای کیت Poly(A) Polymerase
1.بررسی بیان microRNA
افزودن نوکلوئید A جهت اتصال پرایمر طراحی شده در مرحله سنتز cDNA جهت افزایش طافزایش پایداری مولکولی RNAها جهت انجام آنالیزهای مختلف.
2. ساخت کتابخانه‌های cDNA
بهبود فرآیند کلونینگ و توالی‌یابی RNAها
3.تحقیقات ژنتیکی و بیوتکنولوژی
مطالعه مسیرهای تنظیمی مرتبط با microRNA و mRNA
4. کاربرد در پزشکی
مهندسی و اصلاح RNA برای اهداف درمانی و دارویی.
روش عملی استفاده از کیت
مواد مورد نیاز:
- RNA نمونه
- آنزیم Poly(A) Polymerase
- بافر اختصاصی
- ATP به عنوان سوبسترا
- آب RNase-free
مراحل آزمایش:
1.آماده‌سازی نمونه:
RNA را استخراج کرده و خلوص آنرا با استفاده از نانودراپ بررسی کنید
2.مخلوط کردن اجزای واکنش:
مخلوط واکنش شامل RNA، آنزیم، ATP و بافر را آماده کنید.
| 0.5-15 µg | Total RNA |
| 1 µL | Poly A Polymerase Enzyme |
| 2 µL | 10x Buffer |
| 1µL | Adenosine triphosphate (10mM) |
| variable | RNase free Water |
3.انکوباسیون:
واکنش را در دمای 37 درجه سانتی‌گراد به مدت 30-60 دقیقه انکوبه کنید.
4.توقف واکنش:
آنزیم را غیرفعال کرده و RNA را برای مراحل بعدی خالص‌سازی کنید.
روش‌های غیرفعال‌سازی آنزیم پس از فعالیت
- دناتوراسیون حرارتی:
حرارت 65-70 درجه سانتی‌گراد به مدت 15-10 دقیقه.
- استفاده از مواد شیمیایی:
افزودن EDTA با غلظت نهایی 10mM
- تخلیص RNA
استفاده از کیت استخراج RNA و یا روش فنل-کلروفورم( ترایزول) به منظور حذف آنزیم
بررسی بیان microRNA با استفاده از Poly(A) Polymerase
- افزودن دم پلی‌آ به microRNA
- ساخت cDNA با استفاده از پرایمر طراحی شده حاوی توالی T مکمل دم پلی A
- انجام qPCR
Troubleshootingو راه‌حل‌های پیشنهادی
| مشکل | علت احتمالی | راه‌حل |
| عدم افزودن Poly(A) | کیفیت پایین RNA | بررسی خلوص RNA و استفاده از کیت‌های استخراج بهینه |
| فعالیت پایین آنزیم | عدم نگهداری مناسب آنزیم، فریز و دفریز کردن زیاد ATPو آنزیم | الیکوت کردن ATP و آنزیم در حجم های کمتر |
| عدم تکثیر در qPCR | طراحی نامناسب پرایمرها | استفاده از پرایمرهای اختصاصی و بهینه |
| تخریب RNA | آلودگی به RNase | استفاده از محیط و ابزارهای استریل و عاری از نوکلئاز از جمله میکروتیوب و آب RNase Free |
نکات مهم در استفاده از کیت
- نمونه RNA و RNA پلی آدنیله شده را در دمای 80- نگهداری کنید
- از آب RNase-free استفاده کنید (اتوکلاو به تنهایی RNase را غیرفعال نمی‌کند، بدین منظور باید ابتدا DEPC (دی اتین پایروکربنات) با نسبت 1/1000 با آب مخلوط شده و پس از گذشت 2-12 ساعت (2ساعت در 37درجه سانتی گراد) اتوکلاو کنید.
کیت Poly(A) Polymerase تولیدی شرکت راتین ژن ابزاری قدرتمند برای بررسی بیان microRNA، بهبود فرآیندهای ژنتیکی و تحقیقات بیولوژی مولکولی می‌باشد که با رعایت نکات ذکرشده و اجرای صحیح مراحل، می‌توان به نتایج دقیق و قابل اطمینانی در مطالعات RNA دست یافت