راهنمای جامع سنتز cDNA برای بررسی بیان ژن

مقدمه

سنتز cDNA  یکی از مراحل اصلی در فرایند بررسی بیان ژن با استفاده از تکنیک‌ Real_Time PCR میباشد. در این فرآیند، RNA به کمک آنزیم ترانسکریپتاز معکوس (RT) به cDNA تبدیل می‌شود. انتخاب صحیح آنزیم، پرایمر و شرایط واکنش تأثیر مستقیمی بر دقت و بازدهی این واکنش دارد در این مقاله، علاوه بر بررسی انواع آنزیم‌های RT و پرایمرهای مورد استفاده، یک پروتکل استاندارد برای سنتز cDNA به همراه نکات کلیدی و راهکارهای رفع مشکلات رایج ارائه شده است

1. انتخاب آنزیم ترانسکریپتاز معکوس (RT) مناسب

انواع رایج آنزیم‌ RT

M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus RT)

این آنزیم دارای فعالیت RNAse H ضعیف، دمای کاری ۴۲-۵۰ درجه سانتی‌گراد میباشد که مناسب برای سنتز cDNA بلند و دارای حساسیت کم به مهارکننده‌ها است

نسل های بهینه شده از M_MLV:

با ایجاد جهش های ژنتیکی خودخواسته، علاوه بر افزایش سرعت آنزیم و پایداری دمایی بالاتر(پایداری دمایی تا ۵۵ درجه) ، فعالیت بخش RNAse H به حداقل خود رسیده تا امکان سنتز CDNA از قطعات بلندتر را فراهم آورد و همچنین به علت افزایش دمای عملکردی آنزیم امکان سنتز قطعات RNA با ساختار های ثانویه زیاد را نیز تسهیل کرده است

۲. انتخاب پرایمر مناسب برای سنتز cDNA

انتخاب پرایمر مناسب تأثیر مستقیمی بر دقت و بازدهی cDNA دارد.

انواع پرایمرها

1.Oligo(dT)

این پرایمر به دم پلی‌آدنین (poly-A) در انتهای mRNA متصل شده و برای سنتز CDNA از MRNA مناسب میباشد 

2.Random Hexamer

توالی‌های تصادفی ۶ نوکلئوتیدی که جهت تولید cDNA از کل RNA سلولی مناسب میباشد، از این پرایمر معمولا جهت تبدیل RNA ویروسی به CDNA در فرایند تشخیص عفونت به RNA Viruses به کمک تست RT_PCR استفاده می‌شود 

3.Gene-Specific (GSPs)

در صورتی که نیاز به سنتز CDNA از ناحیه خاصی از یک ژن خاص را دارید میتوانید از پرایمر اختصاصی طراحی شده برای ناحیه مورد هدف استفاده کنید (به عنوان مثال میتوانید یکی از پرایمر های مورد استفاده در تست ریل تایم PCR که مکمل رشته RNA میباشد نیز استفاده کنید) 

4.پرایمر مخصوص microRNA

پرایمر اختصاصی برای microRNA پلی‌آدنیله شده | دقت بالا برای microRNA | محدود به microRNAهای دارای poly-A |

—

## **۳. پروتکل عملی سنتز cDNA**

### **الف) آماده‌سازی RNA و حذف آلودگی DNA ژنومی**
#### **۱. بررسی کیفیت و خلوص RNA:**
– کیفیت RNA را با نسبت جذب **A260/A280** در نانودرآپ بررسی کنید (بین ۱.۸ تا ۲ باشد).
– RNA را روی ژل آگارز ۱٪ الکتروفورز کنید تا از عدم تخریب آن اطمینان حاصل شود.

#### **۲. حذف DNA ژنومی:**
🔬 **مخلوط واکنش DNase-treatment (۱۰ میکرولیتر):**
– **RNA (۱۰۰-۵۰۰ نانوگرم):** ۸ میکرولیتر
– **DNase I (1 U/µL):** ۱ میکرولیتر
– **DNase Buffer (10X):** ۱ میکرولیتر

✅ **شرایط انکوباسیون:**
– ۳۷°C به مدت **۱۰ دقیقه**
– غیرفعال‌سازی DNase با گرما: ۷۵°C به مدت **۱۰ دقیقه**

—

### **ب) سنتز cDNA**
🔬 **مخلوط پرایمینگ RNA (۱۰ میکرولیتر):**
– **RNA توتال (از مرحله قبل):** ۸ میکرولیتر
– **پرایمر مناسب (Oligo(dT)، Random Hexamer یا GSPs):** ۱ میکرولیتر
– **dNTPs (10 mM):** ۱ میکرولیتر

✅ **شرایط انکوباسیون:**
– **۶۵°C به مدت ۵ دقیقه** → سپس روی یخ قرار دهید.

🔬 **مخلوط نهایی سنتز cDNA (۲۰ میکرولیتر):**
– **مخلوط پرایمینگ (از مرحله قبل):** ۱۰ میکرولیتر
– **بافر 5X RT:** ۴ میکرولیتر
– **MgCl₂ (در صورت نیاز):** ۱ میکرولیتر
– **RNAse Inhibitor (40 U/µL):** ۰.۵ میکرولیتر
– **آنزیم RT (200 U/µL):** ۱ میکرولیتر
– **DEPC-treated آب:** تا حجم نهایی ۲۰ میکرولیتر

✅ **برنامه انکوباسیون:**
1. **۴۲-۵۰°C به مدت ۵۰-۶۰ دقیقه** (بسته به نوع آنزیم)
2. **۸۵°C به مدت ۵ دقیقه** (برای غیرفعال‌سازی آنزیم)
3. **روی یخ قرار دهید و یا در -۲۰°C ذخیره کنید.**

—

## **۴. نکات مهم و بهینه‌سازی‌ها**
✅ **RNA خالص و بدون آلودگی DNA ژنومی استفاده کنید.**
✅ **از RNAse Inhibitor برای جلوگیری از تخریب RNA استفاده کنید.**
✅ **برای RNAهای با ساختار پیچیده از آنزیم RT مقاوم به حرارت استفاده کنید.**
✅ **پرایمر مناسب را بسته به نوع RNA هدف انتخاب کنید.**

—

## **۵. مشکلات رایج (Troubleshooting) و راه‌حل‌ها**

### **۱. بازده پایین cDNA**
❌ **علت:** کیفیت پایین RNA، دمای نامناسب، وجود مهارکننده‌ها
✔ **راه‌حل:** بررسی کیفیت RNA، افزایش دما برای RNAهای دارای ساختارهای ثانویه

### **۲. آلودگی به DNA ژنومی**
❌ **علت:** حذف ناکامل DNA ژنومی
✔ **راه‌حل:** استفاده از DNase قبل از RT، طراحی پرایمرهای اختصاصی برای exon-exon junction

### **۳. سیگنال ضعیف در qPCR پس از RT**
❌ **علت:** بازده پایین سنتز cDNA، مقدار ناکافی RNA
✔ **راه‌حل:** افزایش مقدار RNA اولیه، استفاده از آنزیم RT قوی‌تر، بهینه‌سازی واکنش

—

## **۶. جمع‌بندی**
سنتز cDNA یک مرحله کلیدی در مطالعات بیان ژن است که نیازمند دقت بالا در انتخاب آنزیم، پرایمر و شرایط واکنش است. رعایت پروتکل استاندارد و توجه به نکات بهینه‌سازی باعث افزایش دقت و بازدهی این فرآیند می‌شود. در نهایت، کنترل کیفیت RNA و استفاده از روش‌های رفع آلودگی DNA ژنومی از عوامل کلیدی در موفقیت این فرآیند محسوب می‌شوند.

### **آیا نیاز به مشاوره تخصصی در سنتز cDNA دارید؟**
تیم ما آماده ارائه مشاوره و تأمین آنزیم‌ها و معرف‌های مورد نیاز شما در آزمایشگاه‌های بیولوژی مولکولی است. برای دریافت اطلاعات بیشتر با ما تماس بگیرید!