HyperTherm SynFusion Reverse Transcriptase | آنزیم ترنسکریپتاز معکوس پایدار در دمای بالا

HyperTherm SynFusion Reverse Transcriptase یک آنزیم رونوشت‌بردار معکوس (Reverse Transcriptase) مهندسی‌شده است که با هدف افزایش پایداری حرارتی، افزایش بازده سنتز cDNA طراحی شده است.

این آنزیم با افزودن دو قطعه پروتئینی در N-terminal و C-terminal به همراه جهش‌های نقطه‌ای هدفمند، توانایی فعالیت پایدار در دماهای بالاتر نسبت به RTهای رایج را پیدا کرده و تا 65°C پایداری عملکردی نشان می‌دهد.

این ویژگی باعث بهبود عملکرد در نمونه‌های RNA پیچیده، دارای ساختارهای ثانویه قوی و یا GC-rich می‌شود.

ویژگی‌های کلیدی HyperTherm SynFusion RT

1. پایداری حرارتی بالا (High Thermostability)

این آنزیم در بازه دمایی 45 تا 65 درجه سانتی‌گراد عملکرد فعال دارد.

افزایش دمای واکنش موجب:

• باز شدن ساختارهای ثانویه RNA
• افزایش دسترسی پرایمرها
• بهبود راندمان سنتز cDNA
• کاهش خطاهای ناشی از ساختارهای ثانویه و پیچیده RNA

2. حذف فعالیت RNase H (RNase H Minus)

در این آنزیم، به واسطه موتاسیون های هدفمند، دومن RNase H غیرفعال شده است.

مزایا:

• افزایش طول cDNA سنتز شده
• تولید cDNA کامل‌تر (Full-length cDNA)
• کاهش تخریب قالب RNA در حین واکنش
• مناسب برای RNAهای بلند (تا حدود 13 kb)

3. حساسیت و بازده بالا

HyperTherm SynFusion RT قادر است سنتز cDNA را از مقادیر پایین RNA انجام دهد:

• 5 ng تا 5 µg RNA
• مناسب برای نمونه‌های سرم، پلاسما و… که مقدار RNA کمی دارند

اجزای کیت

• آنزیم HyperTherm SynFusion Reverse Transcriptase
• بافر اختصاصی آنزیم
• DTT (Dithiothreitol)

مقایسه عملکرد با SuperScript IV

تفسیر نتایج:

• در دمای 55 درجه فعالیت بهینه در هر دو آنزیم مشاهده می‌شود
• در دماهای بالاتر، پایداری عملکرد حفظ می‌شود
• افزایش دما باعث افت شدید راندمان نمی‌شود، که نشان‌دهنده مقاومت حرارتی مناسب آنزیم است

کاربردهای اصلی

• سنتز cDNA برای qPCR
• RNA-seq library preparation
• بررسی ژن‌های بلند (Long transcript analysis)
• نمونه‌های RNA با ساختار ثانویه قوی
• RNAهای GC-rich
• مطالعات بیان ژن (Gene expression analysis)

نتایج بررسی بیان ژن با استفاده از این محصول

بررسی میزان بیان hsa-miR-155

بررسی میزان بیان TLR-8 در نمونه خون کامل

نتیجه بررسی میزان بیان U6-snRNA

بررسی میزان بیان Beta-actin در نمونه خون کامل

سوالات متداول(FAQ)

مزیت حذف DTT از بافر چیست؟

DTT نقش مهمی در حفظ ساختار آنزیم دارد، اما به دلیل حساسیت به شرایط نگهداری (اکسیداسیون و فریز-دفریز)، جدا بودن آن در برخی فرمولاسیون‌ها باعث:

• افزایش پایداری کیت در طول زمان
• کاهش تغییرات عملکردی در ذخیره‌سازی
  می‌شود.

دمای بهینه عملکرد چقدره؟

با وجود تحمل دمایی بالا، بهترین بازده عملکردی آنزیم در بازه 50-55 درجه سانتی گراد دیده می‌شود.

آیا این آنزیم برای microRNA مناسب است؟

بله، در کیت microRNA cDNA Synthesis Kit از همین  آنزیم استفاده شده است.

تفاوت RNase H+ و RNase H- چیست؟

RNase H- باعث حفظ RNA template و تولید cDNA طولانی‌تر و کامل‌تر می‌شود، اما در RNase H+ بخشی از فعالیت آنزیم صرف تجزیه RNA الگو میشود که بازده سنتز را کاهش می‌دهد.

آیا این آنزیم برای RNAهای طولانی مناسب است؟

بله، به دلیل غیرفعال بودن RNase H و پایداری حرارتی بالا، برای RNAهای بلند تا حدود 13 kb مناسب است.

جمع‌بندی

HyperTherm SynFusion Reverse Transcriptase یک آنزیم RT مهندسی‌شده با تمرکز بر پایداری حرارتی بالا، دقت بیشتر و بازده بهتر در سنتز cDNA است.این محصول جهت سنتز از mRNA بلند با ساختار ثانویه پیچیده و GC rich بهینه شده است.

مقالات علمی مربط با آنزیم ترنسکریپتاز معکوس

• Full-Length cDNA Synthesis for Long-Distance RT-PCR of Large mRNA Transcripts(Hawkins, P. R., Jin, P., & Fu, G. K. (2003))

• High-fidelity mRNA amplification for gene profiling(Wang, E., Miller, L., Ohnmacht, G. et al)

• Abortive reverse transcription by mutants of Moloney murine leukemia virus deficient in the reverse transcriptase-associated RNase H function(Tanese N, Telesnitsky A, Goff SP. 199)
• The RNase H Domain: Structure, Function and Mechanism(Nowotny, M., Figiel, M. (2013))

دانلود بروشور محصول