سنتز cDNA
راهنمای جامع سنتز cDNA برای بررسی بیان ژن
مقدمه
سنتز cDNA یکی از مراحل اصلی در فرایند بررسی بیان ژن با استفاده از تکنیک Real_Time PCR میباشد. در این فرآیند، RNA به کمک آنزیم ترانسکریپتاز معکوس (RT) به cDNA تبدیل میشود. انتخاب صحیح آنزیم، پرایمر و شرایط واکنش تأثیر مستقیمی بر دقت و بازدهی این واکنش دارد در این مقاله، علاوه بر بررسی انواع آنزیمهای RT و پرایمرهای مورد استفاده، یک پروتکل استاندارد برای سنتز cDNA به همراه نکات کلیدی و راهکارهای رفع مشکلات رایج ارائه شده است
- انتخاب آنزیم ترانسکریپتاز معکوس (RT) مناسب
انواع رایج آنزیم RT
M-MLV (Moloney Murine Leukemia Virus RT)
این آنزیم دارای فعالیت RNAse H ضعیف، دمای کاری ۴۲-۵۰ درجه سانتیگراد میباشد که مناسب برای سنتز cDNA بلند و دارای حساسیت کم به مهارکنندهها است
نسل های بهینه شده از M_MLV:
با ایجاد جهش های ژنتیکی خودخواسته، علاوه بر افزایش سرعت آنزیم و پایداری دمایی بالاتر(پایداری دمایی تا ۵۵ درجه) ، فعالیت بخش RNAse H به حداقل خود رسیده تا امکان سنتز CDNA از قطعات بلندتر را فراهم آورد و همچنین به علت افزایش دمای عملکردی آنزیم امکان سنتز قطعات RNA با ساختار های ثانویه زیاد را نیز تسهیل کرده است
۲. انتخاب پرایمر مناسب برای سنتز cDNA
انتخاب پرایمر مناسب تأثیر مستقیمی بر دقت و بازدهی cDNA دارد.
انواع پرایمرها
1.Oligo(dT)
این پرایمر به دم پلیآدنین (poly-A) در انتهای mRNA متصل شده و برای سنتز CDNA از MRNA مناسب میباشد
توالیهای تصادفی ۶ نوکلئوتیدی که جهت تولید cDNA از کل RNA سلولی مناسب میباشد، از این پرایمر معمولا جهت تبدیل RNA ویروسی به CDNA در فرایند تشخیص عفونت به RNA Viruses به کمک تست RT_PCR استفاده میشود
3.Gene-Specific (GSPs)
در صورتی که نیاز به سنتز CDNA از ناحیه خاصی از یک ژن خاص را دارید میتوانید از پرایمر اختصاصی طراحی شده برای ناحیه مورد هدف استفاده کنید (به عنوان مثال میتوانید یکی از پرایمر های مورد استفاده در تست ریل تایم PCR که مکمل رشته RNA میباشد نیز استفاده کنید)
4.پرایمر مخصوص microRNA
در این خصوص دو روش سنتز وجود دارد که به طور خلاصه یکی از روش ها استفاده از پرایمر با ساختار حلقوی که انتهای 3′ این پرایمر آزاد بوده و مکمل حدود 6 نوکلئوتید از قسمت 3′ میکرو RNA بوده، میباشد که نیاز به طراحی اختصاصی برای هر microRNA میباشد، بدین معنی که برای بررسی بیان هر microRNA, نیاز به سنتز cDNA جداگانه میباشد
روش دوم استفاده از پرایمر بلندی که علاوه بر قسمت backbone که مشابه ساختار حلقوی در پرایمر قبلی عمل میکند، دارای توالی 12_18 نوکلئوتیدی T جهت اتصال به توالی Poly A اضافه شده به سر 3′ microRNA میباشد( در این فرایند ابتدا تمامی microRNA ها توسط آنزیم Poly(A) Polymerase پلی آدنیله شده و سپس در یک مرحله میتوان تمامی microRNA ها را با پرایمر طراحی شده به cDNA تبدیل کرد, بدین معنی که نیاز به مراحل جداگانه سنتز cDNA برای هر microRNA نیست) این نوع واکنش در مطلب جداگانه ای توضیح داده میشود
۳. پروتکل عملی سنتز cDNA
الف) آمادهسازی RNA و حذف آلودگی DNA
۱. بررسی کیفیت و خلوص RNA:
-کیفیت RNA را با نسبت جذب **A260/A280** در نانودرآپ بررسی کنید (بین ۱.۸ تا ۲ باشد)
RNA -را روی ژل آگارز ۱٪ الکتروفورز کنید و با مشاهده باند های rRNA از عدم تخریب RNA اطمینان حاصل کنید
۲. حذف DNA ژنومی:
در صورتی که از ترایزول ویا کیت استخراج بهینه استفاده کنید، نیازی به این مرحله وجود ندارد اما در صورت مشاهده باند DNA در الکتروفورز، به منظور حذف آن میتوان از پروتکل زیر استفاده کرد
مثالی از واکنش DNase :
حجم نهایی واکنش 10میکرولیتر
– RNA**8 میکرولیتر(100تا 1000نانوگرم)
– **DNase I (1 U/µL):** ۱ میکرولیتر
– **DNase Buffer (10X):** ۱ میکرولیتر
✅ **شرایط انکوباسیون:
– انکوباسیون در دمای۳۷درجه سانتیگراد به مدت ۱۰ دقیقه
– به منظورغیرفعالسازی DNase با گرما: انکوباسیون در دمای72 درجه به مدت ۱۰ دقیقه
ب) سنتز cDNA
10میکرولیتر از واکنش مرحله قبل و یا 100-1000 نانوگرم RNA
4 میکرولیتر از بافر 5X اختصاصی آنزیم RT
1 میکرولیتر آنزیم Reverse Transcriptase
2میکرولیتر dNTP (40mM)
1میکرولیتر پرایمر
رساندن به حجم نهایی 20میکرولیتر توسط آب فاقد نوکلئاز
✅برنامه انکوباسیون:
در صورت استفاده از پرایمر های رندوم هگزامر و یا اختصاصی ژن به منظور اتصال پرایمر، میتوان در دمای 25 درجه به مدت 10 دقیقه انکولاسیون کرد اما در صورت استفاده از الیگو dT نیاز به این مرحله نیست
1. **42-60C° به مدت ۵۰-۶۰ دقیقه (بسته به نوع آنزیم)
2. **۸۵C° به مدت ۵ دقیقه (برای غیرفعالسازی آنزیم)
3. **روی یخ قرار دهید و یا در -۲۰°C ذخیره کنید
—
۴. نکات مهم و بهینهسازیها
✅ RNAخالص و بدون آلودگی DNA ژنومی استفاده کنید.
✅به منظور جلوگیری از تخریب RNA میتوانید به RNA، RNase Inhibitor بزنید.
✅برای RNAهای با ساختار پیچیده از آنزیم RT مقاوم به حرارت استفاده کنید تا با افزایش دمای مرحله سنتز، ساختارهای ثانویه باز شده و دسترسی آنزیم بیشتر شود
✅پرایمر مناسب را بسته به نوع RNA هدف انتخاب کنید
—
۵. مشکلات رایج (Troubleshooting) و راهحلها
۱. بازده پایین cDNA
❌ علت: کیفیت پایین RNA، دمای نامناسب، وجود مهارکنندهها
✔ راهحل: بررسی کیفیت RNA، افزایش دما برای RNAهای دارای ساختارهای ثانویه، استفاده از RNase Inhibitor
۲. آلودگی به DNA ژنومی
❌ علت: حذف ناکامل DNA ژنومی
✔ راهحل: استفاده از DNase قبل از RT، طراحی پرایمرهای اختصاصی برای exon-exon junction، در صورت استفاده از TRIzol و کیت استخراج بهینه، این مشکل تا حد بسیار زیادی برطرف می شود
۳. سیگنال ضعیف در qPCR پس از RT
❌ علت: بازده پایین سنتز cDNA، مقدار ناکافی RNA
✔ راهحل:افزایش مقدار RNA اولیه، بهینهسازی واکنش
—
۶. جمعبندی
سنتز cDNA یک مرحله کلیدی در مطالعات بیان ژن است که نیازمند دقت بالا در انتخاب آنزیم، پرایمر و شرایط واکنش است. رعایت پروتکل استاندارد و توجه به نکات بهینهسازی باعث افزایش دقت و بازدهی این فرآیند میشود. در نهایت، کنترل کیفیت RNA و استفاده از کیت و محلول های استاندارد استخراج RNA از عوامل کلیدی در موفقیت این فرآیند محسوب میشوند.
آیا نیاز به مشاوره تخصصی در سنتز cDNA دارید؟
تیم ما آماده ارائه مشاوره و تولید آنزیمها و معرفهای مورد نیاز شما می باشد. برای دریافت اطلاعات بیشتر با ما در ارتباط باشید.